2023—2024年中国鸽源A组轮状病毒(Group A Rotavirus, RVA)荧光定量RT-PCR(反转录实时荧光定量PCR, RT-qPCR)检测方法的建立与应用

《Viruses》：Development and Application of a Fluorescence Quantitative RT-PCR Assay for Detection of Group A Rotavirus Among Pigeons in China from 2023 to 2024

　　

摘要：A组轮状病毒(RVA)是引起鸽子腹泻的重要病原，近年来在中国鸽养殖业中造成了较大经济损失。为阐明中国鸽群中RVA的流行状况及遗传多样性，本研究建立了检测RVA的荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法。该RT-qPCR方法特异性、敏感性、重复性及重现性良好，对RVA的最低检测限(limit of detection, LOD)为1×102copies/μL。研究人员应用所建RT-qPCR方法检测2023—2024年采自中国10个省活禽市场的645份鸽子拭子样品，以明确鸽源RVA(Pigeon-origin RVA, PiRVA)的流行病学现状。结果显示，中国鸽群中PiRVA的RT-qPCR检出阳性率为12.24％(79/645)；所调查的10个省中以贵州省阳性率最高(42.86％)。研究人员应用特异性引物扩增9株代表性PiRVA阳性样本的VP7和VP4基因并对其进行系统发育分析，结果表明所有鸽源RVA均属于G18P[17]基因型，但存在一定的遗传变异。本研究为鸽RVA的临床诊断提供了有用工具，并为深入了解中国鸽群中鸽源RVA的流行病学特征提供了有价值的信息。

论文解读：2023—2024年中国鸽源A组轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立与流行病学及分子特征分析

A组轮状病毒(Group A Rotavirus, RVA)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)，为无囊膜、二十面体对称双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)病毒，其基因组由11个dsRNA节段编码6个结构蛋白(VP1–VP4、VP6、VP7)和6个非结构蛋白(NSP1–NSP6)，其中VP7和VP4分别为决定G基因型和P基因型的独立中和抗原。RVA是感染鸽群的主要轮状病毒血清组，幼鸽感染后可出现腹泻、脱水等症状，若合并其他病原感染可显著提高死亡率，给养鸽业带来经济损失。RVA于1981年首次从比利时鸽群粪便中检出，日本及欧洲学者报道野生及家养鸽群RVA阳性率可达32.4％～100％，而中国既往禽轮状病毒研究多集中于鸡，针对鸽源RVA(Pigeon-origin RVA, PiRVA)的检测方法及流行病学数据较为缺乏；虽有高通量测序报道但成本高、操作复杂，难以满足临床快速检测需求。为此，研究人员拟针对PiRVA保守区设计引物探针，建立特异、灵敏的一步法荧光定量RT-PCR(RT-qPCR，即反转录实时荧光定量PCR)方法，并应用该方法开展全国多省流行病学调查及代表毒株的VP7、VP4基因序列与系统发育分析，以填补国内相关数据空白，该论文发表于《Viruses》。

主要关键技术方法：研究人员下载NCBI中PiRVA基因组序列比对后针对VP6保守区设计引物与CY5/BHQ-1标记探针并建立RT-qPCR反应体系；将体外转录RNA标准品10倍系列稀释绘制标准曲线；以常见禽病原核酸验证特异性，10倍稀释标准品评估敏感性(最低检测限, limit of detection, LOD)与批内/批间变异系数(coefficient of variation, CV)；用40份临床疑似样品与传统RT-PCR及测序比对；应用所建RT-qPCR检测2023—2024年采自中国10省活禽市场645份鸽子口咽与泄殖腔混合拭子开展流行率调查；对9株不同来源阳性样本用常规RT-PCR扩增VP7与VP4基因并测序，采用MEGA6.0软件邻接法(neighbor-joining method)构建系统发育树(1000次bootstrap校验)进行分子进化分析。

研究结果

3.1. Standard Curve of the Fluorescence Quantitative RT-PCR（荧光定量RT-PCR标准曲线）

研究人员将PiRVA体外转录RNA标准品10倍系列稀释后扩增，获得标准曲线Y=?3.571X+41.815，相关系数R²=0.996，斜率?3.571，表明所建RT-qPCR扩增效率良好。

3.2. Specificity and Sensitivity of the Fluorescence Quantitative RT-PCR（荧光定量RT-PCR的特异性和敏感性）

以PiRVA及禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)、鸽冠状病毒(Pigeon Coronavirus, PiCoV)、鸽圆环病毒(Pigeon Circovirus, PiCV)、鸽腺病毒(Pigeon Adenovirus, PiAdV-A/B)、鸽疱疹病毒(Pigeon Herpesvirus, PiHV)、鸡轮状病毒(Chicken Rotavirus, CRV)核酸进行特异性验证，仅PiRVA出现CY5特异性荧光信号，其余病原均无扩增曲线，证明方法特异性强。10倍系列稀释标准品检测显示最低检测限(LOD)为1×10²copies/μL。

3.3. Repeatability and Reproducibility of the Fluorescence Quantitative RT-PCR（荧光定量RT-PCR的重复性与重现性）

用5个浓度标准品检测批内与批间变异，RT-qPCR的Ct值批内变异系数(CV)为0.02％～0.04％，批间CV为0.00％～0.02％，表明方法重复性与重现性满意。

3.4. Comparison of the Fluorescence Quantitative RT-PCR with the Conventional RT-PCR（荧光定量RT-PCR与传统RT-PCR的比较）

对40份山东疑似感染鸽组织样品并行检测，RT-qPCR检出15份PiRVA阳性(经测序确认)，传统RT-PCR检出12份阳性；两者符合率92.5％，Kappa值0.83，提示所建RT-qPCR敏感性高于传统RT-PCR。

3.5. Prevalence Survey of PiRVA in China（中国PiRVA流行情况调查）

用所建RT-qPCR检测10省(湖南、河南、江苏、四川、安徽、广西、贵州、湖北、广东、江西)活禽市场645份无症状鸽混合拭子，总体PiRVA阳性率12.24％(79/645)；各省中以贵州省最高(42.86％)，广东省未检出阳性。79份阳性样出自54个采样点，其中活禽零售市场阳性采样点占比55％(22/40)，活禽批发市场为57.14％(8/14)，提示活禽市场可能是PiRVA传播与混合感染的重要场所。

3.6. Gene Sequencing and Phylogenetic Analysis（基因测序与系统发育分析）

选取9株不同省份阳性样本扩增产物的VP7与VP4基因测序并比对GenBank已知序列。VP7基因均归入G18基因型进化分支，核苷酸同源性88.3％～100％，与中国已报道SX-05株、ARO株及国外G18株具有一定同源性(90.4％～99.1％)。VP4基因均归入P[17]基因型进化分支，核苷酸同源性89.9％～99.2％，与中国台湾NPUST-001株、美国K1802315株、中国SX-05株、ARO株及澳大利亚VIC株分别具有较高同源性(90.1％～98.4％)。结果表明中国流行PiRVA均为G18P[17]基因型，但存在一定遗传差异与潜在基因节段重组现象。

讨论与结论总结

研究人员成功基于PiRVA VP6基因保守区建立了特异、灵敏(LOD=10²copies/μL)、重复性好的一步法RT-qPCR检测方法，较传统RT-PCR敏感性更高，适用于临床鸽RVA早期快速诊断。应用该方法首次评估了中国10省活禽市场无症状鸽群PiRVA感染状况，总阳性率12.24％，呈散在分布，贵州最高，广东未检出，活禽批发与零售市场阳性采样点比例均超55％，提示需加强市场监管与休市消毒。分子流行病学分析发现中国流行PiRVA均为全球鸽群主要流行的G18P[17]基因型，但VP7与VP4基因存在地域间遗传差异及可能重组，需持续监测并推进疫苗研发以防控鸽RVA在中国鸽群中的传播。