Enterovirus D68（肠道病毒D68）VP1与VP3决定人脊髓类器官中的神经嗜性

《Viruses》：Enterovirus D68 VP1 and VP3 Determine Neurotropism in Human Spinal Cord Organoids

　　

摘要：Enterovirus D68（EV-D68）是一种非脊髓灰质炎肠道病毒，可引起一种脊髓灰质炎样的瘫痪性疾病——急性弛缓性脊髓炎（Acute Flaccid Myelitis, AFM）。2018年后美国EV-D68相关的AFM病例有所减少，其原因尚不清楚。近期研究表明，病毒结构蛋白VP1和VP3中含有点突变的EV-D68在不同新生小鼠模型中导致的瘫痪程度降低。然而，这些突变在多人细胞中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）模型中的表型尚不清楚。研究人员假设，VP1和VP3的突变同样会指导人脊髓类器官（human Spinal Cord Organoids, hSCOs）中的神经嗜性。为此，研究人员重建了含有VP3（I88V）或VP1（L1I/N2D/T98A/E283K或L1P/V148A/K282R）突变的病毒并感染hSCOs。研究发现，VP3 I88V和VP1 L1I/N2D/T98A/E283K导致病毒滴度和病毒蛋白染色降低，与已发表的小鼠模型中的减毒神经毒力一致。通过免疫荧光，研究人员还发现VP1 L1P/V148/K282R突变改变了细胞嗜性，主要感染胶质细胞而非神经元细胞。当这些突变组合时，其对神经嗜性的影响不具有叠加效应。对近期流行EV-D68毒株的序列分析显示，自2014年以来，VP3 I88和VP1 E283一直是优势氨基酸残基，而VP1位点1、2和98具有更高的群体多样性，表明这些残基可能促使2018年后新出现的神经毒力降低。

论文解读：Enterovirus D68 VP1与VP3决定人脊髓类器官中的神经嗜性

研究背景与意义

Enterovirus D68（EV-D68）是微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）中的一种非包膜非脊髓灰质炎肠道病毒，除引起严重呼吸道疾病外，还与儿童中出现的脊髓灰质炎样瘫痪疾病——急性弛缓性脊髓炎（Acute Flaccid Myelitis, AFM）密切相关。2014年起EV-D68大规模循环并伴随AFM高峰，但2018年后美国AFM病例显著减少，其机制不明。既往研究利用小鼠模型发现，EV-D68结构蛋白VP1和VP3的特定点突变可降低神经毒力和瘫痪表型，但不同研究因小鼠遗传背景、接种途径（腹腔IP、颅内IC、肌肉IM）及对照无毒株（MO/14-18949、CA/14-4231）差异得出不同关键突变集。此外，小鼠模型缺乏人类中枢神经系统的多细胞环境及完整固有免疫元件。为此，研究人员利用已建立的人脊髓类器官（human Spinal Cord Organoids, hSCOs）这一多人细胞CNS模型，在统一背景下重评估已报道的VP1和VP3突变对神经嗜性及细胞嗜性的影响，并结合流行株序列分析探讨2018年后AFM减少的病毒进化基础。本研究发表于《Viruses》。

主要关键技术方法

研究人员基于EV-D68 US/IL/14-18952（rEV-D68 18952）感染性克隆（pUC19-EVD68_49131），采用NEBuilder HiFi DNA Assembly法构建重组病毒：含VP3 I88V（rVP3-I88V-MO）、VP1三突变L1P/V148A/K282R（rVP1-3AA-MO）、VP1四突变L1I/N2D/T98A/E283K（rVP1-4AA-CA）及五突变组合（rVP3-I88V/VP1-4AA-CA），以rFermon和亲本rEV-D68 18952为对照。病毒于HEK293T细胞转染 rescue 后经RD细胞扩增至蔗糖垫离心纯化。先在RD细胞（人横纹肌肉瘤细胞）中以MOI 0.01 PFU/细胞测定生长曲线（TCID₅₀，Spearman–K?rber法）。再将体外分化14–18天的人脊髓类器官（3-DiSC hSCOs，由人iPSC经3-DiSC方案分化）以10⁴PFU/池（12个类器官）感染，检测上清滴度及96 hpi免疫荧光（VP1、dsRNA、神经元标记Tuj1、胶质标记S100β）。群体进化分析从BV-BRC下载2014–2024年全球EV-D68序列（n=1968），NextClade比对参考株Fermon（AY426531.1），统计VP1/VP3特定位点替换频率。

研究结果

3.1. Recombinant EV-D68 with Mutations in VP1 and VP3 Replicate Efficiently in RD Cells

研究人员成功构建并拯救各重组EV-D68。以MOI 0.01 PFU/细胞感染RD细胞，在0–96 hpi每24 h取上清测TCID₅₀。结果显示所有重组病毒在24 hpi即可检出感染颗粒，生长曲线与对照rEV-D68 18952相似，表明引入VP1/VP3点突变未在RD细胞中造成明显复制缺陷，为后续hSCOs实验提供合格病毒 stock。

3.2. rVP3-I88V-MO and rVP1-4AA-CA Have Decreased Viral Replication in hSCOs

hSCOs感染10⁴PFU各重组病毒，96 hpi固定后做VP1及鬼笔环肽（phalloidin）免疫荧光。量化VP1平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI）发现，与rEV-D68 18952相比，rVP3-I88V-MO和rVP1-4AA-CA的VP1信号显著减弱；rVP1-3AA-MO与亲本无显著差异。生长动力学显示，在48和96 hpi，rVP3-I88V-MO和rVP1-4AA-CA的上清病毒滴度显著低于rEV-D68 18952，而rFermon未测到滴度，rVP1-3AA-MO与亲本相当。结论：VP3 I88V及VP1 L1I/N2D/T98A/E283K在多人CNS细胞中降低复制适合度，与小鼠模型神经毒力减毒表型一致；VP1 L1P/V148A/K282R不影响hSCOs总体复制。

3.3. rVP1-3AA-MO Colocalizes Primarily with Glial Cells Whereas rVP1-4AA-CA and rVP3-I88V-MO Colocalize Primarily with Neuronal Cells

为探明细胞嗜性，研究人员用dsRNA（病毒复制标记）、神经元标记Tuj1、胶质细胞（星形胶质/少突胶质等）标记S100β对96 hpi的hSCOs双染色。rEV-D68 18952、rVP1-4AA-CA及rVP3-I88V-MO感染中，dsRNA与Tuj1共定位为主，表明嗜神经元；而rVP1-3AA-MO感染中dsRNA主要与S100β共定位，即转向嗜胶质细胞。提示VP1的L1P/V148A/K282R突变改变受体/辅因子互作（邻近MFSD6互作位点G149），重塑细胞嗜性。

3.4. rVP3-I88V/VP1-4AA-CA Results in Decreased Viral Replication in hSCOs Compared to rEV-D68 18952

研究人员将VP3 I88V与VP1四突变组合成rVP3-I88V/VP1-4AA-CA，在RD细胞中验证复制正常后感染hSCOs。结果与单突变趋势一致：相比rEV-D68 18952，组合突变在48、96 hpi显著降低上清滴度及VP1 MFI，免疫荧光显示VP1信号减弱。单氨基酸突变（VP1 L1I、N2D、T98A、E283K分别引入）在hSCOs中未单独显著降低滴度。表明在hSCO模型中，VP3 I88V与VP1四突变的表型非叠加也非协同，符合各自独立作用且未达 abortive 表型。

3.5. Substitution Frequency of EV-D68 VP1 and VP3 Residues of Interest Since 2014

研究人员分析1968条全球序列（2014–2024）。VP3 88位：I88为优势（仅3株V88），说明I88V极少在自然循环中存在，不太驱动近年AFM下降。VP1 283位：E283稳定优势（仅7株K283）。而VP1位点1、2、98变异度高：I1占61%，D2占59%（部分演化为E2），A98占43%（T98→非极性A/I/V）。这些位点的电荷/极性改变（如N2→酸性D/E，T98→非极性A）可能影响BC-loop柔性及MFSD6介导的受体结合，与2018年后特别是2022年EV-D68反弹但AFM未同步高峰相关。

讨论与结论总结

讨论指出，hSCO直接接种模拟CNS定向感染，避开了血脑屏障穿越或轴突逆向运输变量，补充了小鼠IM/IP与IC模型的差异解释。rVP1-3AA-MO的胶质嗜性转变可能与VP1 V148A邻近MFSD6互作区（G149）有关。序列流行病学显示VP3 I88和VP1 E283稳定，而VP1 1/2/98受选择压驱动变异，或部分解释临床神经毒力降低。但宿主免疫、监测偏差、环境等非病毒因素亦参与AFM流行病学变化。

结论（翻译浓缩）

研究人员在多人细胞人CNS模型（hSCOs）中评估了既往报道的EV-D68神经毒力决定子。重组病毒感染得出与小鼠模型相似的复制表型，并新发现rVP1-3AA-MO改变细胞嗜性。VP3 I88V与VP1 L1I/N2D/T98A/E283K组合未产生叠加或中止表型。对2014年以来临床分离株的点突变频率评估发现VP1位点1、2和98存在显著持续进化，或可解释临床表型变化及神经毒力减弱。这表明EV-D68持续快速适应进化，强调继续监测当代流行株及系统评估结构/非结构蛋白神经毒力驱动因子的重要性。