《Biology》：Imaging-Based Spatial Transcriptomics: Data Interpretation Methods and Biomedical Applications
基于成像的空间转录组学（spatial transcriptomics）已从低通量（low-plex）单分子荧光原位杂交（single-molecule fluorescence in situ hybridization，smFISH）发展为一类多样化的高多重（highly multiplexed）平台，并在近期具备了多模态（multimodal）与病理兼容（pathology-compatible）能力。尽管不同平台在化学体系、编码方式及成像策略方面存在显著差异，其生物学解释通常汇聚于若干具有代表性的计算生物学问题。本综述从数据解读与应用的视角审视基于成像的空间转录组学，重点关注将原始荧光信号或配套的原位测序（in situ sequencing，ISS）数据转换为分子、细胞及组织层级表征的分析框架。文中讨论了预处理、配准、图像复原、特征检测、条形码解码、分子判定、细胞分割、转录本分配、概率性细胞分型、空间域推断及图谱整合等关键挑战；同时强调，光学拥挤（optical crowding）、组织厚度、探针面板偏倚以及多模态复杂性会进一步提升计算难度。最后，综述总结了基于成像的空间转录组学技术的应用范围，涵盖从亚细胞 RNA 定位到图谱尺度（atlas-scale）及病理感知（pathology-aware）空间分析等多个方向。
1. Introduction
文章首先指出，传统整体 RNA 测序由于对大群体细胞信号进行平均，难以解析组织中决定功能与病理状态的细胞异质性。单细胞与单核转录组学虽显著提升了细胞类型、过渡状态与谱系关系的表征能力，但其解离流程会破坏组织结构与细胞空间关系。为克服这一局限，空间转录组学（spatial transcriptomics）通过在测量基因表达的同时保留位置信息而兴起。作者将相关技术概括为捕获式（capture-based）与基于成像式两大类，后者直接通过显微成像读取空间表达模式。围绕基于成像的方法，正文进一步区分了基于原位杂交（in situ hybridization，ISH）与基于原位测序（in situ sequencing，ISS）或扩增读出的技术路线，并强调这类方法的共同核心并不只是实验化学，而是必须把原始荧光或扩增信号可靠地转化为分子、细胞和组织层面的可解释表示。因此，计算分析并非下游附属步骤，而是决定数据质量与生物学解释能力的中心环节。
2. Technological Evolution of Imaging-Based Spatial Transcriptomics
2.1. From smFISH to Combinatorial Barcoding and Error-Robust Decoding
这一部分回顾了基于成像的空间转录组学如何起源于单分子荧光原位杂交（smFISH）。smFISH 通过多个探针识别同一转录本，使单个 RNA 分子以衍射极限斑点形式被可视化，从而在不进行扩增的条件下实现定量原位计数并保留亚细胞位置信息。其局限在于多重化能力较低，难以同时解析大量转录本。为提升通量，研究发展出序贯杂交（sequential hybridization）策略，即不再依赖单轮单荧光信号识别转录本，而是通过多轮杂交、成像与剥离构建有序荧光条形码。由此，转录本识别转变为跨轮次组合编码问题，理论编码容量随荧光种类数 F 与杂交轮次 N 增长。随后，MERFISH 通过引入受限汉明距离（Hamming distance）的码本设计，提高了解码的容错性，使转录本身份恢复成为噪声条件下的显式解码问题。文章还指出，除 MERFISH 外，不同平台还通过伪彩色稀释、更短条形码以及扩增后读出等方式降低错误并提高可扩展性，说明多重化能力的提升既依赖实验设计，也依赖计算优化。
2.2. Optical Crowding and Distinct Strategies for Scaling Multiplexed Imaging
作者随后讨论限制高多重成像扩展的关键瓶颈——光学拥挤（optical crowding）。随着检测基因数与高丰度转录本增加，更多 RNA 分子会在有限空间内以衍射极限斑点出现，导致信号重叠并降低定位与解码精度。文中指出，这种限制根源于显微镜点扩散函数（point-spread function，PSF）所决定的横向与轴向分辨率，因此在三维组织体积内，可独立分辨的 RNA 密度存在物理上限。多轮成像中，这一问题还会叠加光漂白、探针去除不完全与轮次相关信号衰减等因素，进一步增加条形码缺失与解码歧义。针对这一瓶颈，综述归纳了三类扩展策略：其一是通过物理扩增空间来拉开 RNA 分子间距，如扩增荧光原位杂交（ExFISH）、扩增辅助 MERFISH 以及扩增测序（ExSeq）；其二是通过在更大的编码空间中重新分散信号以降低单幅图像局部密度，典型代表为 seqFISH+ 的伪彩色稀释策略；其三是有意限制多重化水平，以稳健性和组织尺度成图为优先，如 osmFISH 采用非条形码循环 smFISH 方案。作者借此强调，高通量扩展并非单一路径，而是围绕“如何在保持可读性的同时控制局部信号密度”这一核心问题展开。
2.3. In Situ Sequencing and Amplified Readout Strategies in Imaging-Based Spatial Transcriptomics
这一节聚焦于引入原位测序（ISS）与扩增读出的技术演进。与以未扩增 RNA 斑点为对象的 smFISH 衍生平台不同，这类方法将分子识别转向组织内扩增产物的循环读出，使高强度信号更适用于厚组织与体积成像。文章指出，在空间转录组学领域，ISS 一词已超越最初狭义的逐碱基或连接测序含义，也涵盖借助 padlock 探针与滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）形成扩增模板、再通过循环杂交或条形码模式恢复分子身份的方案。STARmap 被视为该方向代表，其整合了水凝胶组织化学、靶向扩增及原位连接测序；Deep-STARmap 进一步支持厚度约 60–200 μm 的三维组织块分析。ExSeq 则将扩增显微学与原位测序结合，实现复杂组织中纳米尺度和亚细胞尺度的 RNA 读出。此后，HybISS、直接 RNA 靶向 HybISS、Xenium、RAEFISH 与 PRISM 等方法继续扩展了这一家族。作者在计算层面强调，这些扩增型平台并非完全独立于其他成像空间转录组算法体系，而应被视为循环图像解码问题的不同测定变体，其共同任务仍包括检测斑点或扩增子、跨轮次整合信号并进行身份判定。
2.4. Extending Imaging-Based Spatial Transcriptomics to Complex Specimens and Multimodal Readouts
文章指出，早期平台多在薄切片或技术条件较理想的样本上建立，后续发展则逐渐转向复杂样本适配、多模态读出以及标准化分析流程。一个重要方向是拓展至厚组织体积成像，例如三维 MERFISH 结合共聚焦光学切片与深度学习图像增强，实现对厚脑组织的转录本分析。另一方向是与蛋白质定位及病理信息整合，如 STARmap PLUS 将空间转录组与蛋白定位联用，CosMx/SMI 与 Xenium 则推动了甲醛固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）样本中的亚细胞分辨率 RNA/蛋白检测。作者同时强调，FFPE 兼容性并不自动等同于临床稳健性，因为固定时间、组织处理、储存时长、去石蜡、抗原修复、RNA 片段化及自发荧光等预分析变量都会影响信号强度与检测效率。多模态病理流程还引入了跨模态配准难题，即 RNA、蛋白、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色及功能成像之间需要通过基于标记点或形态学引导的可变形配准维持空间一致性。整体而言，这一阶段表明该领域已从单纯追求转录本多重化，转向重视样本兼容性、病理适配、商业化扩展与转化医学应用。
3. Data Processing from Images to Molecule
3.1. Image Preprocessing and Quality Control
本节讨论从原始多轮、多通道、常常还包含三维体积信息的荧光图像出发，如何通过预处理和质量控制（quality control，QC）建立可靠的分子表示。作者指出，这类原始图像常受照明不均、自发荧光背景、光漂白、焦平面变化及样本依赖性光学伪影影响，而这些因素都会扭曲后续分子检测与解码结果。除图像质量本身外，数据规模也是关键瓶颈，多轮多通道三维采集可为单个样本生成数百 GB 至 TB 级数据，因此存储布局、压缩方式、元数据跟踪以及输入输出效率都成为分析流程的一部分。文中提及 OME-Zarr、OME-NGFF 与 SpatialData 等框架对大规模生物图像和空间组学数据管理的重要性，但同时提醒，压缩与降采样若脱离分子检测性能考虑，可能丢失低丰度转录本对应的弱斑点信号。预处理策略需结合平台与样本类型具体设计，例如 osmFISH 注重照明校正与背景扣除，而三维厚组织数据更需处理离焦荧光、球差及深度依赖信号衰减。质量控制不应仅在下游实施，而应伴随成像过程，通过标记点稳定性、跨轮次信号分布、背景特征以及不同视野或重复样本中的可重复性加以评估。
3.2. Registration and Alignment
由于循环成像方法要在多个轮次中重复拍摄同一物理区域，因此配准（registration）直接关系到分子身份恢复，而非简单图像对齐。若不同轮次或通道之间存在微小位移，同一条形码轨迹就可能被错误拼接，从而影响分子赋值。作者指出，MERFISH 与 seqFISH 类流程通常采用基于标记点的平移、刚性或仿射配准，并配合色差校正，以确保同一 RNA 分子在重复杂交周期中的定位一致；而 STARmap 等扩增辅助 ISS 方法则需要在测序循环间对同一扩增子进行对齐，必要时还要引入局部可变形校正。对于三维成像，Z 轴漂移与深度相关畸变也不可忽视。作者强调，配准质量评估不能仅依赖视觉重叠效果，还需结合标记点残差、跨轮次稳定特征匹配、分子恢复率、条形码一致性及重复样本重现性等指标综合判断。
3.3. Deconvolution and Denoising for Image Restoration
随着数据愈发致密且样本厚度增加，图像复原（image restoration）在准确恢复分子信号中的作用日益突出。该部分将复原概括为去卷积（deconvolution）与去噪（denoising）等操作，其目的在于改善特征可分离性，增强后续检测与解码性能。经典模型驱动方法包括 Richardson–Lucy 与 Wiener 去卷积，常见去噪方法则包括非局部均值、基于小波的滤波以及 BM3D。作者指出，这些方法虽无需训练数据，但效果强烈依赖噪声假设和参数设置，过度平滑可能削弱弱 RNA 斑点或改变强度分布。近年来，RedLionfish 与 Deconwolf 等开源工具使大体积荧光数据去卷积更加实用，而 CARE 等学习型方法则通过 U-Net 类神经网络从低信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）图像映射至高 SNR 图像。进一步地，JSIT、BarDensr 与 ISTDECO 体现了“复原—解码一体化”思路，即将点扩散函数感知模型、稀疏性约束与码本信息联合用于位置和身份推断。与此同时，作者提醒，过强复原尤其是学习型复原可能产生幻觉性斑点、扭曲信号形态或造成深度依赖性过校正，因此其评价必须以分子恢复、解码一致性、空白码行为及下游细胞分型稳定性为准，而不能只凭图像视觉效果判断。
3.4. Detection of Punctate or Amplified Molecular Features
在预处理与配准之后，分子特征检测构成从图像到候选分子对象转换的关键步骤。对于杂交型实验，目标通常是代表单个 RNA 或条形码读出事件的斑点；对于扩增辅助 ISS 流程，则是更亮且空间上更扩展的扩增子或 rolony。文中以 osmFISH 中基于高斯拉普拉斯（Laplacian-of-Gaussian，LoG）增强、局部极大值搜索与阈值判定的经典流程为例，说明稀疏高 SNR 斑点可采用可解释的模型驱动方法。对于高密度样本，seqFISH+ 需要更复杂的定位分析以分离邻近信号。作者还提到，RS-FISH 通过利用近圆形点扩散函数几何特征实现亚像素定位，适用于大规模二维/三维 FISH 图像；而 Spotiflow、Polaris、deepBlink 与 U-FISH 等深度学习工具则在低 SNR、异质背景及大规模数据场景中展现出优势。不同检测策略在可解释性、训练依赖性、对阈值和背景的敏感性方面各有权衡。检测质量会直接塑造分子点云：漏检造成假阴性，伪检测引入假阳性，合并或拆分对象则会扭曲丰度估计与后续身份恢复，因此必须结合召回率、精确率与下游分子调用表现综合评估。
3.5. Barcode Decoding and Molecule Calling
本节阐述如何把跨轮次观测转化为具体分子身份，即条形码解码（barcode decoding）与分子判定（molecule calling）。在 MERFISH 中，这通常表现为二进制读出模式与码本匹配；在 seqFISH 类系统中，则涉及定位匹配与伪彩色赋值；在 STARmap 和 ExSeq 等平台中，则更接近多轮颜色模式的测序式解码。尽管实现形式不同，其本质都是在不完整且含噪的多轮观测下，将信号轨迹映射到有效分子身份。作者指出，解码性能由码本设计、配准精度、特征检测质量以及实验特异性噪声结构共同决定。光漂白、杂交不完全与剥离低效会导致预期“开”位缺失或轮次残留，从而增加解码歧义。分子判定阶段通常需要执行字典匹配或序列赋值，并剔除无效或低置信模式；若实验包含空白码（blank barcode）或空值码（null barcode），还可直接经验性估计误识别率。作者借 Polaris 等一体化流程说明，检测与解码不应总被视为完全独立的两个阶段，而应在统计模型中联合考虑，从而更稳健地完成由图像信号到空间分子表示的过渡。
4. Data Interpretation from Molecules to Cells and Tissue Organization
4.1. Cell Segmentation and Transcript-to-Cell Assignment
当分子点云被恢复后，下一步是将其转化为细胞解析度表达矩阵，即细胞分割与转录本到细胞的分配。文章强调，单分子级别数据尽管精细，但若不能关联至特定细胞，则难以支撑细胞分型、差异表达、空间域推断与细胞互作分析。早期方法主要依赖细胞核染色、poly(A) 染色或 watershed 分割，但在致密组织、形态复杂细胞及边界标记弱的样本中效果有限。随后，方法逐渐转向利用转录本坐标参与边界推断。pciSeq 通过概率框架扩展细胞核边界并联合分配转录本与细胞身份；Baysor 则将细胞建模为空间连贯且具有特征性转录组成的分子分布，可选整合辅助染色但并不绝对依赖。进一步的方法如 Proseg、CelloType 与 Bering 分别采用无监督概率建模、多任务学习及图嵌入迁移等策略，说明细胞分割已从形态驱动转向转录本感知与不确定性感知。作者特别强调，转录本分配并非分割后的次要实现细节，而是决定细胞×基因矩阵质量的核心环节；在神经元、免疫细胞浸润及厚组织中，延伸突起、边界重叠和膜标记稀疏会显著增加归属歧义。FastReseg、resolVI、DenoIST、SPLIT 以及 SpaceBender 等方法分别从局部重分配、后分割表达去混合、污染转录本去除和空间噪声建模等角度缓解误差传播，提示细胞层级表达矩阵应被视为带有不确定性的推断结果，而非无误差真值。
4.2. Segmentation-Free Analysis and Local Molecular Composition
作者进一步指出，并非所有分析都必须先获得最终细胞边界。对于高分辨率空间转录组数据，局部转录本邻域本身就可编码重要生物学结构，因此出现了无分割（segmentation-free）分析策略。这类方法直接在分子坐标或局部组成上建模，而不强制预设细胞轮廓。Baysor 研究中提出的邻域组成向量（neighborhood composition vector）用附近转录本相对频率构建空间索引的伪细胞表示，可揭示组织结构、局部细胞状态混合与斑块样分子结构。FICTURE 则通过可扩展空间因子分解，在不显式分割细胞的情况下推断局部分子模式。该节表明，现代基于成像的空间转录组学并不应被理解为“成功分割”与“分割失败”的二元选择，而更像是一组具有不同空间分辨率和建模假设的分子表示谱系。
4.3. Cell Typing, Reference Mapping, and Probabilistic Classification
在细胞分型方面，文章描述了从基于标志基因的启发式识别向参考引导和概率分类转变的过程。早期靶向面板研究多通过聚类后结合经典标志基因指认细胞类型，但随着单细胞 RNA 测序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）图谱逐渐完善，空间细胞分型越来越依赖参考映射，即将空间数据中一个细胞的靶向原位表达模式与同组织类型的 scRNA-seq 图谱中最相似细胞进行整合。pciSeq 是这一方向的典型实例，Whole-brain MERFISH atlas 则借助典型相关分析（canonical correlation analysis，CCA）与 k 近邻分类完成精细细胞注释和转录组推断，CNS STARmap PLUS atlas 也采用 Harmony 整合和近邻标签转移实现中枢神经系统细胞图谱构建。作者同时提醒，参考依赖型注释会把既有图谱的假设、分辨率限制及采样偏倚传递到空间解释中，因此应结合标志基因表达、空间定位、置信度评分以及无监督分析共同验证。由此，细胞分型更适合理解为一种带置信权重的推断过程，而非直接标签恢复。
4.4. Spatial Domains, Tissue Regions, and Atlas Alignment
在超越单细胞类型标注之后，分析重点逐渐转向更高阶的组织结构推断，包括空间域、解剖区域与连续梯度。文章指出，这些组织层级结构往往不能简化为细胞类型标签之和，因为组织中存在区域特异性排列、边界过渡与局部成分模式。osmFISH 研究通过聚类与空间统计重建体感皮层解剖组织，并量化细胞类型之间的共定位或回避关系；seqFISH+ 使用隐马尔可夫随机场（hidden Markov random field，HMRF）识别无法仅由细胞类型解释的空间域；Whole-brain MERFISH atlas 通过与 Allen Common Coordinate Framework 配准，揭示脑组织存在空间模块和连续梯度；CNS STARmap PLUS atlas 也从空间生态位基因表达出发推断组织区域。作者由此强调，在图谱尺度研究中，将空间域映射到共同坐标系和参考分类体系是实现跨个体、跨切片比较的关键步骤，而 STIM 等框架则说明三维重建、可视化与配准本身也是分析过程的一部分。
4.5. Spatial Interaction Analysis and Higher-Order Tissue Interpretation
最后，本节讨论在细胞或局部分子邻域被置于空间语境后，如何进一步推断空间互作与高阶组织解释。病理导向平台在这一转变中尤为突出。CosMx/SMI 将邻域与生态位分析整合进高多重 RNA–蛋白工作流，用于解析肿瘤—微环境结构、细胞状态组合以及潜在配体—受体相互作用模式；STARmap PLUS 则将阿尔茨海默病模型中的转录状态与淀粉样 β（amyloid-β）斑块和异常磷酸化 tau 的病理特征相联系，揭示病灶中心周围的空间微环境。更进一步，CellNEST 采用注意力机制建模细胞间通信及中继样互作结构，Nicheformer 则通过可迁移的生态位感知嵌入把局部微环境建模推进到表征学习层面。作者据此指出，空间解释对象不再只是单个细胞，还包括重复出现的多细胞邻域、病灶中心生态位与病理相关空间状态。
5. Biomedical Applications
5.1. Subcellular RNA Organization
这一部分强调，基于成像的空间转录组学的独特优势之一，是不仅能够回答“哪些转录本被表达”，还能回答“这些转录本在细胞内何处定位”。MERFISH 和 seqFISH+ 已显示不同转录本可富集于细胞核、内质网、胞质周边或突起等不同区室；ExSeq 进一步在树突棘、分支及其他纳米级结构中检测 RNA。作者据此指出，亚细胞 RNA 组织本身可被视为一种可测量的转录组表型，用于研究局部翻译、细胞极性和区室特异性 RNA 调控。
5.2. Tissue Organization and Spatial Gradients Across Local and Atlas Scales
作者随后总结组织结构与空间梯度层面的应用。早期工作已证明，靶向标志基因面板可以直接从测得的分子空间分布重建皮层组织结构。后续 STARmap 与 MERFISH 研究则将转录组细胞身份与皮层层化、局部细胞排列及投射相关空间模式联系起来。更进一步，MERFISH 在小鼠初级运动皮层和全脑尺度揭示了连续分子梯度、空间模块与发育程序，说明空间转录组学能够表征动态发育和连续变化，而不仅是静态解剖分区。图谱级研究还把细胞身份、局部邻域和全局参考坐标系统一起来，为跨个体比较与多尺度解释提供了框架。
5.3. Disease Microenvironments and Pathology-Compatible Spatial Profiling
在疾病和病理应用方面，文章重点讨论了肿瘤及神经退行性疾病场景。肿瘤样本兼具高度异质性、结构依赖相互作用和临床病理兼容需求，因此构成空间方法的严格检验环境。CosMx/SMI 支持在 FFPE 组织中实施高多重 RNA/蛋白成像并结合形态引导分割，从而识别肿瘤与基质细胞状态、病理相关空间生态位及潜在细胞互作。相关研究进一步扩展至脑肿瘤、小细胞肺癌等临床样本。除肿瘤外，STARmap PLUS 还在阿尔茨海默病模型中同时映射转录状态与病理标志物，揭示病灶周围结构化病理微环境。Light-Seq 与 MOSAICA 等平台则展示了影像引导的空间索引和临床材料多重 RNA–蛋白检测等互补性转化路径。
6. Computational Challenges and Future Directions
文章最后总结了若干核心计算挑战。首先，光学拥挤并不仅是成像分辨率问题，还会沿分析链条传播为定位、解码、分子判定、细胞分割、细胞分型及互作分析中的统计不确定性，因此未来需要更多保留置信信息的概率化表示。其次，细胞边界推断仍是细胞分辨率解释的中心难题，尤其在高密度组织、强极化细胞和弱染色样本中更为突出。第三，参考整合显著增强了靶向面板的解释能力，但也使空间标签继承参考图谱的偏倚与分辨率限制。第四，三维、多模态及病理感知分析放大了深度衰减、配准畸变、跨模态对齐和数据标准化等问题，使可扩展可视化、共同坐标系对齐和三维重建成为分析本体的一部分。最后，深度学习方法虽然广泛应用于复原、检测、分割、转录本分配与参考映射，但其可靠性高度依赖训练和验证数据的代表性。作者强调，评估不应停留于图像视觉质量或分类准确率，而应纳入分子恢复率、假阳性/假阴性行为、细胞×基因矩阵稳定性、标签置信度以及跨平台泛化能力。总体而言，本文认为该领域未来的关键，不再只是测量更多基因，而是提升空间解释的保真度与不确定性感知能力，从而推动空间转录组学由描述性分子制图走向更具机制性的空间系统生物学。
