银杏基因组尺度N6-甲基腺苷（m6A）甲基化调控蛋白（Writer与Eraser）的全基因组鉴定及表达谱分析

《Biology》：Genome-Wide Characterization and Expression Profiling of Putative m6A Methylation Regulatory Proteins (Writers and Erasers) in Ginkgo biloba

　　

N⁶-甲基腺苷（m6A）是植物转录后调控中重要的RNA修饰。然而，银杏（Ginkgo biloba）中推测的m6A writer和eraser尚缺乏系统研究。本研究中，通过全基因组分析共鉴定出17个候选m6A调控基因，包括8个writer和9个eraser。系统发育和结构分析表明，这些蛋白总体保守，部分成员显示潜在的功能分化。启动子分析揭示丰富的激素和胁迫响应顺式作用元件，表达谱分析显示组织特异性模式及对ABA、MeJA和NaCl处理的动态响应，其中eraser比writer表现出更强的转录响应性。此外，蛋白相互作用网络和相分离预测提示其在RNA甲基化相关过程中的潜在作用。这些结果为银杏m6A调控的进一步功能研究奠定基础。

银杏（Ginkgo biloba）作为裸子植物中的活化石物种，兼具重要的进化研究价值与药用开发前景。N⁶-甲基腺苷（m6A，即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰）是真核生物mRNA（信使核糖核酸）中最丰富的内部化学修饰，构成转录后基因调控的关键层级，广泛参与mRNA稳定性维持、剪接加工及翻译效率调控等RNA代谢环节，进而调控植物的生长发育与环境胁迫响应。该修饰的动态可逆调控由三类蛋白协同完成：writer（ writers，甲基转移酶，主要由甲基转移酶样蛋白METTL及其辅助组分构成，负责催化m6A标记在RNA转录本上的沉积）、eraser（去甲基化酶，主要为AlkB同源蛋白ALKBH家族成员，负责移除外加的m6A修饰以确保表观遗传过程的可逆性）以及reader（reader蛋白，通常含YTH结构域，特异性识别m6A修饰的RNA并触发下游调控级联）。其中，writer与eraser构成m6A修饰动态调控的核心机器，而reader主要发挥下游效应器功能。

尽管m6A调控因子的鉴定与功能表征已在多种开花植物中广泛开展，证实了其在组织依赖性表达及脱落酸（ABA）、盐胁迫、茉莉酸甲酯（MeJA）等非生物胁迫响应中的保守与物种特异性作用，但在裸子植物中的研究仍然匮乏。前人虽在银杏中鉴定了推测的m6A reader蛋白，为m6A修饰RNA的识别提供了初步线索，但针对直接控制m6A标记沉积与移除的writer和eraser的系统分析尚付阙如。此外，现有研究提示m6A调控蛋白可能参与蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络及液-液相分离（LLPS）等更为复杂的分子过程，这些机制被日益认为是组织RNA代谢和转录后调控的重要方式，然而在裸子植物中同样缺乏表征。鉴于writer和eraser对理解m6A修饰的动态调控至关重要，且其在PPI网络和相分离中的潜在作用有待探索，研究人员遂开展了此项针对银杏推测m6A writer和eraser的全基因组鉴定与系统分析，以期为裸子植物的表观转录组调控研究提供基础。

研究样本来源于南京林业大学培养的五个月龄银杏植株的根、茎、叶组织，以及经100 μM ABA、100 μM MeJA和100 mM NaCl处理后0、6、12、24、48小时采集的叶片样本。关键技术方法包括：基于HMMER和BLASTP的全基因组筛选结合保守结构域数据库（CDD）验证以鉴定候选蛋白；利用ProtParam和WoLF PSORT进行理化性质与亚细胞定位预测；采用MAFFT多序列比对和IQ-TREE3构建最大似然法（ML）系统发育树；运用MEME和NCBI CDD进行保守基序与结构域分析；借助TBtools进行染色体定位、基因复制与共线性分析；通过PlantCARE预测启动子顺式作用元件；基于STRING数据库预测PPI网络并用Cytoscape-MCODE模块分析；采用PLAAC、IUPred2A、FuzDrop和catGRANULE 2.0四种计算工具预测LLPS相关特征；通过qRT-PCR（定量实时聚合酶链式反应）检测基因表达，以GAPDH为内参基因采用2^?ΔΔCT法计算相对表达量。

研究结果部分，"银杏推测m6A writer和eraser的鉴定与特征分析"显示，共鉴定出17个推测m6A调控蛋白，包括8个writer和9个eraser。这些蛋白序列长度变异显著，writer为144-979个氨基酸（aa），eraser为241-845 aa；分子量相应为15.91-109.74 kDa和27.76-91.17 kDa；理论等电点（pI）分别为5.11-7.90和5.80-9.65，提示eraser具有更广泛的pI分布。所有蛋白GRAVY值均为负，表明其主要为亲水性蛋白，与其RNA代谢功能相符。亚细胞定位预测显示多数定位于细胞核，少数分布于细胞质、叶绿体或线粒体，提示潜在的功能分化。

"推测m6A writer和eraser的系统发育分析"表明，writer蛋白可分为MTA、MTB、MTC、FIP37、FIONA1、VIR和HAKAI七个保守亚家族，各亚家族成员通常聚类且支持度高，说明m6A甲基转移酶机器的主要组分在陆生植物进化中高度保守。银杏writer蛋白多与油松（Pinus tabuliformis）同源基因优先聚类，反映裸子植物内的进化保守性。值得注意的是，油松中鉴定到VIR同源基因，但银杏中未检测到，可能反映谱系特异性分歧。Erasers即ALKBH蛋白则分化为ALKBH1、ALKBH2、ALKBH6、ALKBH8、ALKBH9和ALKBH10等保守分支，银杏ALKBH蛋白同样与油松同源基因关系密切。但ALKBH7同源基因在银杏和油松中均未检测到，提示裸子植物内的谱系特异性缺失。部分ALKBH亚家族在不同植物谱系中成员数量不均等，暗示谱系特异性扩张或功能分化。

"推测m6A writer和eraser的保守结构域与基序分析"揭示，不同蛋白亚家族呈现特征性的基序分布模式。Writer中，GbMTA1A和GbMTA1B含6个保守基序，GbMTA2A含5个但缺失基序5；GbMTB含3个保守基序；而GbMTC、GbHAKAI、GbFIP37和GbFIONA1在选定参数下未检测到共有保守基序，即使优化MEME参数后结果依旧，推测这与这些蛋白相对于核心MTA/MTB蛋白的高度序列分歧有关。Erasers中，GbALKBH9A、GbALKBH10A和GbALKBH10B含6个保守基序，GbALKBH9B仅3个；GbALKBH1A、GbALKBH1B和GbALKBH6仅含基序1；GbALKBH2和GbALKBH8未鉴定到保守基序。结构域分析确认所有蛋白均含特征性m6A相关功能域：writer的MTs亚家族含保守MT-A70结构域，GbFIP37、GbHAKAI和GbFIONA1分别含WTAP、RING-HC_HAKAI样和AdoMet_MTases结构域；部分蛋白还携带额外结构域如GbMTB的PRK13700超家族、GbHAKAI的PRK10263和PAT1相关结构域等。所有eraser含保守2OG-Fe^II-Oxy和AlkB结构域，部分成员还具PHA03247、zf-C2HC5或RRM等附加结构域。

"m6A writer和eraser基因的染色体分布与共线性分析"显示，17个基因不均匀分布于9条染色体上，各染色体基因数较少。鉴定到两对串联重复基因：第4染色体上的GbMTA1A-GbMTA1B和第11染色体上的GbALKBH9A-GbALKBH9B。全基因组内仅发现1对片段复制基因。银杏与油松的种间共线性分析鉴定出7对直系同源基因对，其中2对属于writer（GbMTB和GbMTC），5对属于eraser（GbALKBH2、GbALKBH6、GbALKBH8、GbALKBH10A和GbALKBH10B），表明片段复制在银杏m6A调控基因扩张中作用有限，而与油松的种间共线性则指示裸子植物间相对保守的进化关系。

"PPI网络的功能富集分析"构建的网络包含11个m6A相关蛋白和9个非m6A相关蛋白。基因本体（GO）富集分析显示网络富集于mRNA甲基化、RNA甲基化、RNA修饰等生物学过程，分子功能类别涵盖甲基转移酶活性、去甲基化酶活性和RNA结合，细胞组分则富集于RNA N⁶-甲基腺苷甲基转移酶复合物和核斑。MCODE分析识别两个主要模块：模块1主要富集于mRNA甲基化相关过程和甲基转移酶活性；模块2富集于mRNA甲基化及胚胎发育、胚后发育等发育过程。

"LLPS相关特征的计算预测"采用四种互补预测工具综合评估。PLAAC仅在GbHAKAI中鉴定到高置信度朊病毒样结构域（PrLD，COREscore = 19.245）。IUPred2A在15/17个蛋白中检测到长内在无序区（IDR，≥50 aa），GbALKBH10B的IDR最长（约580 aa）。FuzDrop预测10个蛋白具有较高LLPS相关倾向（pLLPS ≥ 0.6），GbALKBH10B、GbHAKAI和GbALKBH2值最高（>0.99）。catGRANULE 2.0对大多数蛋白预测为LLPS相关（得分>0.5）。综合四种方法，仅GbHAKAI获全部四项预测支持；GbALKBH10B、GbALKBH2、GbMTA1B、GbALKBH1B、GbALKBH10A和GbMTB六项获三种方法支持。这些结果提示银杏多个推测m6A调控蛋白具有计算预测的LLPS相关特征，GbHAKAI为最强候选。

"推测m6A writer和eraser启动子区的顺式作用元件分析"鉴定到大量激素响应、光响应、植物发育和胁迫响应相关顺式元件。激素响应元件广泛分布，每个基因含至少2个；ABRE（ABA响应元件）和CGTCA/TGACG基序（MeJA响应元件）最为普遍，分别存在于64.71%和41.18%的启动子中，GbALKBH9B含10个MeJA相关元件簇。胁迫诱导序列中，ARE（厌氧诱导元件）存在于88.24%的基因中，MBS（干旱响应元件）存在于41.18%的基因中。光响应元件Box 4和G-box存在于所有启动子中。发育相关基序如CAT-box亦广泛分布，提示这些基因可能作为整合生长程序与环境适应的关键分子开关。

"推测m6A writer和eraser的组织特异性表达模式"分析显示，大多数基因呈现一致的叶>茎>根表达梯度，表明m6A相关过程在叶片发育及相关生理过程中可能发挥重要作用。少数基因呈独特表达谱：GbHAKAI叶中表达显著高于茎和根；GbALKBH8和GbALKBH10B茎叶表达相当且均显著高于根；GbFIP37和GbALKBH9A在各组织中表达丰度均相对较高。Writer基因叶根表达倍数变化为2.53（GbMTA2）至5.01（GbFIP37），eraser基因变化范围更广，为1.61（GbALKBH10A）至10.18（GbALKBH9B），表明不同基因成员间组织特异性调控程度存在实质性差异。

"非生物胁迫处理下的表达谱"显示，ABA处理下多数writer呈"下调-上调"模式，6小时初始抑制后逐渐恢复；eraser相似但早期抑制更显著，多降至0.1-0.4倍。MeJA处理下writer和eraser呈多样表达模式，无一致趋势，GbMTB和GbFIP37变化较大，GbALKBH9A在12小时显著上调，GbALKBH9B从6小时至24小时持续上调（峰值约5倍）。NaCl处理下eraser转录变化较writer更为显著，GbALKBH6在24小时增至约2.5倍，GbALKBH9A在48小时上调约2.2倍，GbALKBH9B在6小时快速响应；GbALKBH10A和GbALKBH10B则持续下调。总体而言，推测m6A调控基因呈胁迫特异性和时间动态性表达模式，eraser基因表现出更高敏感性。

讨论部分，研究人员指出m6A修饰是参与RNA代谢、发育和胁迫适应的关键表观转录组机制，尽管被子植物中研究广泛，裸子植物中仍有限。本研究鉴定的银杏候选蛋白数量和分类与其他种子植物报道基本可比，暗示核心m6A调控机器在植物谱系间的进化保守性。系统发育分析支持银杏蛋白与油松同源基因的密切关系，但VIR同源基因的缺失提示裸子植物进化中的可能谱系特异性分歧。结构分析确认功能结构域的保守性，但部分蛋白基序缺失反映亚家族间的序列分歧。特别值得关注的是，eraser基因对ABA、MeJA和NaCl处理的转录响应通常强于writer基因，这种差异表达模式可能暗示writer维持基础m6A甲基化活性，而eraser在环境变化条件下贡献RNA甲基化的动态调控，类似现象已在高粱和大麦等物种中报道，提示胁迫响应性eraser调控可能跨植物谱系进化保守。启动子中丰富的胁迫和激素响应元件与表达谱结果一致，支持RNA甲基化调控因子在应激适应中的保守作用。组织特异性表达模式则指示功能分化。

关于LLPS，多个推测m6A调控蛋白展现计算预测的LLPS相关特征，特别是GbHAKAI获全部四项预测支持，为最强候选。PPI网络分析提示这些蛋白可能参与RNA加工、发育和胁迫响应相关的复杂调控网络。但研究人员强调这些观察仅基于计算分析，需酶活性测定、亚细胞定位和生物物理LLPS实验等进一步验证。此外，鉴于银杏叶广泛用于药用提取物生产，理解胁迫响应基因的表观转录组调控可能为逆境条件下 pharmacologically active compounds（药理活性化合物）产量提升的育种或栽培策略提供基础。

研究结论部分翻译如下：本研究主要基于全基因组鉴定、计算预测和表达谱分析。这些推测m6A调控蛋白作为writer和eraser的预测功能需进一步的实验验证，包括酶活性测定和m6A水平检测。本研究呈现了银杏中推测m6A writer和eraser基因的全基因组鉴定与特征分析。共鉴定17个候选基因，系统分析了其系统发育关系、结构特征、染色体分布和调控元件。表达分析揭示组织特异性模式及对非生物胁迫的动态响应，eraser总体较writer显示出更高的转录响应性。这些发现表明银杏中推测的m6A writer和eraser在共享保守核心特征的同时表现调控变异，暗示基因成员间潜在的功能分化。该工作为未来阐明m6A修饰在银杏发育和胁迫响应中作用的研究提供了有用资源。此外，鉴于银杏叶富含药用成分，理解m6A修饰的调控可能为未来的表观转录组辅助育种或栽培策略提供信息，以在胁迫条件下增强药理活性成分的产量。