NMDA受体在未成熟大鼠发作后增强中起重要作用

《Frontiers in Synaptic Neuroscience》：NMDA receptors play an important role in postictal potentiation in immature rats

　　

摘要目的：即刻发作后增强（PIP），一种在未成熟动物中观察到的独特现象，可能有助于幼龄动物对癫痫发作和癫痫的敏感性增强。PIP值得更多的实验关注，因为理解其机制可为治疗这些疾病提供有价值的见解。方法：利用皮层后放电（ADs）技术，研究人员分析了谷氨酸受体拮抗剂对12日龄大鼠PIP的影响。记录一个条件性AD，1分钟后记录一个测试AD。然后给予拮抗剂，10分钟后再次诱发另一对AD。结果：最显著的效果出现在ifenprodil上，这是一种选择性拮抗剂，作用于含GluN2B亚基的NMDA受体，该亚基是未成熟动物中的主要形式。该拮抗剂不仅抑制了即刻PIP，还将状况转变为成年样发作后抑制。给药后，测试AD显著短于条件性AD。非选择性NMDA拮抗剂、优先靶向含GluN2A亚基（成年动物中的主要形式）的NMDA受体的拮抗剂，或代谢型谷氨酸受体拮抗剂的效果较弱。相比之下，AMPA拮抗剂对延迟性PIP有主要影响，尤其是IEM 1460，这是一种选择性拮抗剂，作用于缺乏功能性GluR2亚基的AMPA受体，该亚基同样是未成熟动物中的主要形式。结论：PIP似乎是未成熟神经系统中谷氨酸受体独特结构的功能体现，尤其是NMDA受体。亮点：在未成熟大鼠中观察到的是发作后增强（PIP）而非抑制。确定了两种类型的PIP——即刻（长达5分钟）和延迟。即刻PIP归因于含NR2B亚基的NMDA受体。延迟PIP是一种更复杂的现象。在参与延迟PIP的系统中有AMPA受体的作用。

**研究背景与问题**：新生儿期是癫痫发作最高发的时期（Volpe, 2008; Pressler等人, 2021），但这一阶段的标准抗癫痫药物（如苯巴比妥）疗效有限（Silverstein和Jensen, 2007）。未成熟大脑以兴奋性神经元占优势为特征（Silverstein和Jensen, 2007），这种兴奋抑制失衡虽对早期发育至关重要，却使大脑更易发生癫痫反复发作甚至癫痫持续状态（Holmes和Ben-Ari, 2001）。此前在幼年大鼠杏仁核点燃模型中也观察到类似现象（Moshé和Albala, 1983）。因此，阐明未成熟大脑过度兴奋的神经机制，不仅有助于理解早期发育过程，还能为新生儿癫痫设计更有效的治疗方案。**研究目标与结论**：为探究这一机制，研究人员开发了皮层后放电（AD）模型（Mare?等人, 2002; Mare?和Kubová, 2015），发现12日龄大鼠（其皮层发育水平相当于人类足月新生儿，Romijn等人, 1991）在首次电刺激诱发的AD后会出现即刻发作后增强（PIP），即第二次刺激诱发的AD时长显著延长；而成年大鼠则表现为发作后抑制（第二次AD缩短甚至消失）。本研究利用该模型，系统测试了不同谷氨酸受体拮抗剂对PIP的影响，以揭示其分子基础。**主要结论**：PIP由未成熟神经系统中独特的谷氨酸受体组成所驱动，尤其是含GluN2B亚基的NMDA受体（N-甲基-D-天冬氨酸受体，介导兴奋性突触传递）介导即刻PIP，而缺乏功能性GluA2亚基的AMPA受体（α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体，介导快速兴奋性突触传递）参与延迟PIP。**重要意义**：该发现为开发针对新生儿癫痫（尤其是癫痫持续状态）的靶向药物提供了新方向，并提示AMPA受体亚型可能参与新生儿癫痫导致的长期认知缺陷和后遗癫痫易感性（Jensen等人, 1992; Mikati等人, 2005; Rakhade等人, 2008）。论文发表在《Frontiers in Synaptic Neuroscience》。

**主要技术方法**：使用12日龄雄性Wistar品系大鼠（来源：捷克科学院生理学研究所动物设施）。方法包括：在乙醚麻醉下将扁平银电极植入硬膜外（右侧感觉运动皮层放置刺激电极，左侧感觉运动皮层放置记录电极，参考电极置于小脑上方的枕骨）。刺激参数为15秒8Hz双相矩形脉冲（恒流源，强度6mA）。实验流程：记录一对AD（条件刺激C1与1分钟后测试刺激T1），然后腹腔或皮下注射药物（除PEAQX外均为腹腔注射，PEAQX为皮下注射），10分钟后再次记录另一对AD（C2与T2）。通过比较T与C的时长（大代表PIP，小代表发作后抑制）判断药物效应。数据分析采用GraphPad Prism 8，先检验正态性，再行参数或非参数检验（RM one-way ANOVA或ANOVA on Ranks），多重比较校正采用Benjamini-Krieger-Yekutieli方法（q<0.05视为显著）。

**研究结果**（保留原文小标题）：

**对照组（Controls）**：在第一对AD中，测试刺激诱发的AD（T1）显著长于条件刺激诱发的AD（C1），表明典型的PIP。第二对AD（C2和T2）中，T2有长于C2的趋势但差异不显著，且C2显著长于C1，说明存在从第一对延续的残留增强效应。重要的是，T2从未短于C2，即未出现发作后抑制。

**NMDA受体拮抗剂（NMDA receptor antagonists）**：
- 非竞争性NMDA拮抗剂dizocilpine（MK-801）显著改变PIP：给药后第二对AD中T2显著短于C2，即PIP转化为发作后抑制。低亲和力拮抗剂memantine在20 mg/kg剂量下也表现出T2短于C2的趋势，但未达统计学意义。
- 亚基特异性拮抗剂：选择性拮抗含GluN2B亚基NMDA受体的ifenprodil（20和40 mg/kg）完全消除PIP，并将PIP转变为成年样发作后抑制（T2显著短于C2），效果比dizocilpine更显著。相反，优先靶向含GluN2A亚基NMDA受体的PEAQX（20和40 mg/kg）对PIP无效，第二对AD中T2等于C2，且未出现发作后抑制。
- 代谢型谷氨酸受体拮抗剂MTEP（10和20 mg/kg）对PIP无影响，第二对AD结果与对照组相同，T2与C2无差异。

**AMPA受体拮抗剂（AMPA receptor antagonists）**：
- 两种AMPA拮抗剂（竞争性特异性拮抗剂NBQX，以及选择性拮抗缺乏功能性GluA2亚基AMPA受体的IEM 1460）均未显著影响即刻PIP：给后T2相较于C2并未显著缩短。相反，IEM 1460组的第二对AD仍表现出明显的PIP。
- 但AMPA拮抗剂对延迟性PIP（即第一对AD后残留的增强效应）有显著作用：在NBQX（低剂量7.5 mg/kg溶于DMSO或悬浮液）和IEM 1460条件下，C2显著短于T1，甚至接近C1基线，表明延迟增强被消除。更高剂量的NBQX（15和30 mg/kg）则强烈抑制所有AD（C2和T2几乎消失），整体神经元兴奋性被抑制。

**讨论与结论总结**：讨论部分指出，新生儿期神经系统以过度兴奋为特征，这源于GluN2B亚基主导的NMDA受体（较长开放时间、更强Ca²⁺内流、缓慢失活，Paoletti等人, 2013）以及缺乏GluA2亚基的AMPA受体（Ca²⁺通透性增加，Geiger等人, 1995）。本研究验证了这些受体的功能重要性：选择性抑制GluN2B亚基（ifenprodil）使幼年大鼠的PIP逆转为成年样发作后抑制，而抑制GluN2A亚基（PEAQX）无效；AMPA受体（尤其是缺乏GluA2亚基的亚型）则特异性地维持延迟性PIP，这可能解释新生儿易发反复癫痫和癫痫持续状态的原因。结论翻译如下：**结论**：本研究表明，未成熟大脑中的发作后增强（PIP）源于其独特的谷氨酸受体组成。特别是，研究人员发现PIP依赖于含GluN2B亚基的NMDA受体。该亚基在新生儿期唯一地占主导地位，使其成为介导此阶段过度兴奋性的可能候选因素。因此，它应被视为设计治疗新生儿癫痫药物的有吸引力的靶点。研究人员的数据还表明，缺乏GluA2亚基的AMPA受体可能促进新生儿神经元的过度兴奋性和癫痫易感性增加。具体而言，这些受体似乎参与延长AD后的过度兴奋状态。这种延长的兴奋可能是新生儿易发生反复癫痫和癫痫持续状态的基础。同样，由于GluA2亚基缺失是新生儿AMPA受体的主要特征，靶向该受体亚型的拮抗剂可能提供治疗新生儿癫痫持续状态的手段。此外，延长的PIP可能在其他与新生儿癫痫相关的现象中发挥作用。众所周知，新生儿癫痫会导致日后更高的癫痫发病率和认知缺陷发生率。Jensen等人（1992）在10日龄大鼠中建立了缺氧癫痫模型，该模型模拟了许多长期发作后后遗症（Mikati等人, 2005）。有趣的是，他们将这些改变归因于AMPA受体（Rakhade等人, 2008）。因此，开发靶向缺乏GluA2亚基的AMPA受体的药物，不仅可能有助于治疗急性新生儿癫痫（尤其是反复发作），还可能减轻新生儿癫痫的一些有害长期后果。NMDA和AMPA受体拮抗剂的高治疗潜力受到严重副作用的阻碍，包括对记忆和认知的影响。目前临床上唯一使用的NMDA受体拮抗剂是低亲和力拮抗剂美金刚（用于治疗阿尔茨海默病），它没有严重副作用。本研究结果强调了NMDA和AMPA受体在未成熟大脑高癫痫易感性中的重要性，以及寻找无严重副作用的新拮抗剂的必要性。