从顽拗到精准：木豆 robust再生、转化及靶向基因编辑框架的建立

《Frontiers in Genome Editing》：From recalcitrance to precision: a robust regeneration, transformation and targeted gene editing framework in Cajanus cajan

　　

木豆（Cajanus cajan (L.) Millsp.; 2n = 2× = 22）是一种耐旱的多年生 grain legume，主要种植于印度雨养和旱作地区，是全球重要的矿物质和蛋白质天然来源。尽管经过数十年的研究，组织培养相关的限制因素仍然阻碍着该作物的遗传改良，包括外植体无法产生胚性愈伤组织、直接出芽、再生潜力有限以及缺乏有效的转化系统。此外，传统的或分子育种方法用于作物改良存在费时、费资源和劳动力密集的问题。CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated protein 9，成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白9）介导的靶向性状改良方法已成为在多种作物中引入期望遗传修饰的 robust 技术。研究人员旨在报道一种改进的愈伤组织产生、离体再生以及通过基因枪介导的转化系统在木豆中进行 CRISPR 介导的八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase, PDS）基因基因组编辑的 protocol。所用的本土化构建体 CcPDS_NICTK-2_pCRISPR-Cas9 携带木豆密码子优化的 Cas9 和靶标特异性 sgRNA，用于转化木豆外植体（胚轴和子叶节）。在芽诱导培养基中添加定制化的生长调节剂和硝酸银（AgNO₃）使植株再生率提升至约86%（±0.04），转化效率达到46%（±0.04）。测序分析显示原生 CcPDS 基因发生了突变，编辑效率约为10%。此外，这种优化的方法未来可用于产生无标记基因组编辑植株，解决生物安全问题并促进遗传改良作物的接受和商业化。

木豆作为一种重要的 legume 作物，长期因生物和非生物因素面临严重的产量损失。尽管通过遗传转化提高其产量和营养品质的尝试众多，但该作物固有的组织培养顽拗性、可再生组织稀缺以及离体生根困难等问题，导致以往方法的转化频率低下，难以建立稳定可重复的转化体系。此外，传统的分子育种方法费时费力，而 CRISPR/Cas9 技术虽已在多种主要作物中成功应用，木豆中却尚无线索证明通过基因枪介导转化实现基因组编辑的可行性。针对这些瓶颈，研究人员在《Frontiers in Genome Editing》发表了这项研究，旨在建立一套高效的离体芽再生、转化及基因组编辑平台。

研究人员以木豆 PUSA-992 基因型为材料，选用胚轴（embryonic axis, EA）和子叶节（cotyledonary node, CN）作为外植体来源。通过系统优化培养基组分，包括采用半强度 MS 基础盐、细胞分裂素（cytokinin）组合（激动素 kinetin, KN 和玉米素 zeatin, ZEA）、硝酸银以及赤霉素（gibberellic acid, GA₃）等，建立了从 callus 诱导、芽再生、伸长到生根的完整离体再生体系。随后，设计了本土化的无标记 pCAMBIA1300 衍生双元载体 NICTK2-pCRISPR/Cas9，该载体携带鸽豆密码子优化的 Cas9 基因（SpCas9，含两个核定位序列 NLSs）、CaMV 35S 启动子和 poly(A) 终止子，以及靶向 CcPDS 基因第七外显子的 sgRNA 表达盒。通过基因枪（biolistic）方法将构建体导入胚性愈伤组织，经分子检测、序列分析和表型鉴定，成功获得了 PDS 基因编辑的突变体植株。

研究结果部分，"优化木豆外植体的愈伤组织诱导"显示，半强度 MS 基础培养基添加 1.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤（BAP）可获得 90%–95% 的发芽率，优于全强度 MS。CIM5 培养基（0.5 mg/L KN + 1.0 mg/L ZEA）的愈伤组织诱导频率最高，胚轴外植体达 86%，子叶节为 76%，且胚轴的 callus 诱导时间（8天）短于子叶节（12天）。该结果通过 Table 1 的数据支持，表明细胞分裂素单独处理即可实现高效 callus 诱导，无需外源生长素。

"木豆离体再生体系的建立"表明，添加 AgNO₃ 的芽诱导培养基（SIM：0.3 mg/L KN + 0.3 mg/L ZEA + 0.5 mg/L AgNO₃）效果最佳，胚轴再生频率达 89%，子叶节为 76%。芽伸长培养基（SEM）中添加 0.2 mg/L GA₃ 显著促进伸长。生根培养基（RRM）含 0.09 mg/L 吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid, IAA）时生根效率达 72%。再生植株经驯化后表型正常，可开花结实，说明该再生体系可育性良好。

"基因组编辑载体开发及靶标 PDS 基因序列的鉴定"部分，研究人员通过生物信息学分析从 NCBI 数据库鉴定了 CcPDS 基因（参考序列 XM_020357799.2），该基因位于第1号染色体，含13个外显子，编码570个氨基酸。基于保守性分析和 CRISPR RGENE 软件设计了靶向第七外显子的 sgRNA（靶序列 5′-GATCATATTCAGTCCTTGGG-3′），GC含量为50%，并通过 CRISPR-P v2.0 和 Cas-OFFinder 进行了脱靶预测。

"胚轴外植体更适用于基因枪介导转化"表明，虽然子叶节再生频率较高，但胚轴的转化效率更高（46% vs 39%）。对658个胚轴来源的胚性愈伤组织进行基因枪转化后，303株 Cas9 阳性，经 T7 核酸内切酶 I（T7EI）检测发现67株出现额外条带，提示存在突变。

"Cas9 转基因木豆的分子鉴定与表达分析"通过 PCR、Southern blot 和 qRT-PCR 确认了 Cas9 基因的稳定整合（片段大小6–16 kb，单拷贝和双拷贝插入）和表达。Cas9 和 sgRNA 转录本在 T0 和 T1 代中均可检测到，野生型无信号，表明编辑盒稳定表达。

"PDS 基因突变导致木豆产生 premature stop codon"显示，编辑效率为10.01%。Sanger 测序揭示多种突变类型，包括单碱基 G 插入、2 bp（CC）缺失和4 bp（AGTC）缺失等 indels，均导致 premature stop codon 和截短蛋白（328、327、345个氨基酸），而野生型为全长570个氨基酸。突变体呈现三种表型：完全白化、部分白化和淡绿色。

"PDS 基因突变对色素积累的影响"通过分光光度法和共聚焦显微镜检测证实，突变体叶绿素 a、叶绿素 b、总叶绿素和类胡萝卜素含量显著降低，与表型一致。完全白化突变体（如 CcpdsS4）无叶绿素自发荧光，证实为双等位基因突变；淡绿色突变体（如 CcpdsP4）为单等位基因突变；部分白化突变体（如 CcpdsS7）呈嵌合状态，嵌合频率仅6%。

"T0 和 T1 代转基因植株中 Cas9 和 sgRNA 的表达分析"证实编辑盒在两代中稳定表达，sgRNA 转录本可检测到。

"突变在下一代的遗传"表明，CcpdsP88、CcpdsS11 和 CcpdsS51 的 T1 代出现矮化绿苗表型，Cas9 基因遵循孟德尔 3:1 分离比，靶位点突变与 T0 代一致，证实编辑等位基因可稳定遗传。部分突变体（CcpdsP88、CcpdsS11）虽有核苷酸改变但蛋白结构保守，呈绿色表型；CcpdsS51 的 S325L 替换经 AlphaFold2 预测不影响蛋白整体构象（87%置信度），但表现矮化表型。

讨论部分，研究人员指出木豆长期缺乏可重复的组织培养转化技术，以往农杆菌介导方法效率低且受基因型限制。该研究通过优化细胞分裂素组合、添加 AgNO₃ 抑制乙烯活性、促进多分蘖，克服了这一瓶颈。基因枪方法避免了 host-bacteria 互作问题，适用于顽拗性作物，且为未来 DNA-free 编辑和同源性定向修复（HDR）提供了可能。与 Prasad 等（2024）的15.2%和 Senthil 等（2025）的9.16%相比，该研究46%的转化效率和10%的编辑效率均有显著提升。CcPDS 作为视觉标记基因，其突变导致的白化表型验证了编辑系统的有效性，但完全白化植株因光合能力丧失无法形成种子，而绿色矮化突变体可用于后续研究。

研究结论部分翻译如下：该研究成功展示了木豆中基因枪介导的 CRISPR/Cas9 系统，获得了白化表型突变体。研究人员建立了利用胚轴和子叶节作为外植体的 strong 离体植株再生体系，显著提高了转化效率。这一可重复、快速、兼容的 protocol 克服了该作物遗传改良中的重大障碍。植物密码子优化的 Cas9 与 CaMV 35S 调控元件及 sgRNA 相结合，提升了基因编辑效率和突变率。这一突破使得 legume 作物的 gene function 探索和农艺性状改良成为可能，实现了这些物种中高效的 CRISPR/Cas9 基因编辑。