Chara vulgaris介导的硒纳米颗粒：一种抗氧化、抗菌、抗炎和伤口愈合活性的新方法

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Chara vulgaris-mediated selenium nanoparticles: a novel approach to antioxidant, antibacterial, anti-inflammatory, and wound healing activities

　　

背景：Chara vulgaris（C. vulgaris）是一种绿色大型藻类，含有抗氧化和抗菌化合物，在治疗感染和炎症方面具有潜力。Enterococcus faecalis是一种革兰氏阳性机会性病原体，可导致皮肤和软组织感染，尤其在免疫功能低下患者中。由于抗生素耐药性日益增加，需要新的治疗方法。硒纳米颗粒（SeNPs）具有增强的抗菌和抗氧化特性。本研究探索了C. vulgaris衍生的硒纳米颗粒（CV-SeNPs）作为抗E. faecalis感染的治疗剂，旨在抑制生物膜、减少氧化应激、降低炎症并促进伤口愈合。方法：通过高效液相色谱分析（HPLC）对C. vulgaris乙醇提取物中的酚类和黄酮类化合物进行定量。采用DPPH和ABTS自由基清除实验评估抗氧化活性。通过肉汤稀释法和结晶紫微量滴定板实验分别测定抗菌和抗生物膜效果。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察CV-SeNPs对细菌生物膜结构的影响。通过体外伤口愈合实验，利用正常成纤维细胞评估CV-SeNPs的再生潜力。此外，使用酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒测量肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平。结果：C. vulgaris乙醇提取物的HPLC分析显示其含有多种具有抗氧化、抗菌和抗炎活性的化合物。在DPPH和ABTS实验中，与C. vulgaris提取物和游离SeNPs相比，CV-SeNPs表现出显著的抗氧化活性。CV-SeNPs对E. faecalis（n=10）的最低抑菌浓度（MIC）范围在128-1024 μg/mL，覆盖70%的测试菌株。CV-SeNPs显著减少了细菌生物膜形成，与未处理细胞相比，生物膜减少百分比达58.3%，CLSM观察证实了这一结果。体外伤口愈合实验表明，CV-SeNPs加速了愈合过程，在48小时后通过细胞向创口迁移观察到最快愈合速率。此外，CV-SeNPs显著降低了TNF-α和IL-1β的水平，表明其具有潜在的抗炎作用。结论：CV-SeNPs的独特性质表明，该化合物可成为一种有效的抗氧化、抗菌和抗炎剂。

论文解读文章

研究背景：藻类是一类系统发育异质的自养光能微生物，广泛存在于各类水生环境中，从大型海藻到单细胞浮游植物，具有多样的生物医学应用潜力，包括疾病治疗、伤口愈合以及提供具有抗菌、抗氧化和抗炎活性的生物活性代谢物。Chara vulgaris（C. vulgaris）属于绿色藻类链型植物门（Streptophyta），因其结构和繁殖特征被认为是陆地植物最近的现存亲属，是一种沉水淡水绿藻，常见于池塘、湖泊和缓流溪流中。C. vulgaris富含生物活性分子和抗氧化活性，使其具有广泛的潜在医学应用，其明确的抗菌活性提示其在感染治疗中的应用前景，同时其组分中的抗炎和抗氧化活性也使其成为治疗炎症性疾病和氧化应激相关疾病的有前景候选物。这种治疗潜力主要归因于C. vulgaris中存在大量的酚酸和不同种类的黄酮类化合物，包括鞣花酸、对香豆酸、阿魏酸，以及芦丁、木犀草素、芹菜素、儿茶素和槲皮素等。Enterococcus faecalis是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，通常为胃肠道共生菌，但已成为一种重要的机会性病原体。在众多感染中，皮肤和软组织感染（SSTIs）日益重要，尤其在糖尿病患者、免疫功能低下或术后患者等高风险人群中。E. faecalis引起的SSTIs可从皮肤感染如蜂窝织炎和丹毒，到更侵袭性的感染如深部组织脓肿、坏死性筋膜炎和感染性溃疡。在慢性糖尿病足溃疡或压疮中，E. faecalis通常作为多微生物感染的一部分存在，与其他病原体如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）共存，导致愈合延迟和炎症加剧。E. faecalis在皮肤组织以及植入医疗设备（如导管和移植物）上形成生物膜的能力增强了其持久性和耐药性。耐药菌株如万古霉素耐药肠球菌（VRE）的出现进一步对治疗这些感染构成了巨大挑战。因此，早期检测、适当的抗菌治疗、伤口管理和感染控制措施是正确处理E. faecalis相关SSTIs的前提。

硒是一种微量元素，以其强大的抗氧化功能而闻名，在维持体内氧化还原平衡和免疫功能中发挥关键作用。硒的抗氧化活性在控制炎症和免疫应答调节中非常重要，因此在感染性疾病管理中具有重要性。硒纳米颗粒（SeNPs）显示出高生物利用度、增强的抗菌和抗氧化特性，且毒性低于块状硒，这归因于其高表面积、溶解性以及与微生物生物膜相互作用的能力，可与某些天然化合物（如C. vulgaris）联合使用。尽管针对C. vulgaris专门用于伤口愈合的研究非常有限，但藻类生物体长期被认为具有有效的生物活性化合物，具备抗氧化和抗炎属性，以及促进伤口愈合过程的组织再生能力。然而，关于通过提取C. vulgaris生物活性化合物用于活体伤口愈合的信息仍然非常有限。此外，纳米技术的最新进展通过增强的抗菌和再生特性以及控制药物释放，改进了伤口愈合治疗。不同的植物合成纳米材料，如金属、聚合物和复合纳米颗粒，已在临床前和临床试验中显示出有希望的结果。本研究提出了一种绿色合成SeNPs的新方法，其中利用C. vulgaris作为酚酸和黄酮类的生物来源，这些物质在纳米颗粒形成过程中充当天然还原剂和稳定剂。同时，本研究旨在探索C. vulgaris来源的硒纳米颗粒（CV-SeNPs）在靶向治疗E. faecalis感染中的潜力。通过将C. vulgaris的抗氧化和抗菌潜力与SeNPs的最先进递送潜力协同整合，该方法旨在加速感染控制、促进生物膜破坏并增强伤口愈合。

关键技术与方法：研究人员采用了多项关键技术：通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析C. vulgaris乙醇提取物的化学成分；利用高效液相色谱（HPLC）定性和定量检测酚类和黄酮类化合物；使用DPPH和ABTS自由基清除实验评估抗氧化活性；通过肉汤稀释法和结晶紫微量滴定板实验测定最低抑菌浓度（MIC）和抗生物膜活性；采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）双荧光染色观察生物膜结构和细菌活力；利用正常人肺成纤维细胞（WI-38，购自Nawah-Scientific Research Center，开罗，埃及）进行MTT细胞活力实验和体外划痕实验评估伤口愈合；通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测TNF-α和IL-1β水平评估抗炎作用。

研究结果：
3.1 C. vulgaris乙醇提取物及其硒纳米颗粒表征：CV-SeNPs的理化性质包括粒径167.85 ± 60.61 nm、Zeta电位-11.08 ± 1.52 mV、多分散指数（PDI）0.4523 ± 0.07、药物含量28.78 ± 1.66 mg/mL。透射电镜（TEM）显示均质球形颗粒，直径小于100 nm。傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实C. vulgaris乙醇提取物中的多糖和酚类含量有助于SeNPs的稳定。

3.2 C. vulgaris乙醇提取物植物化学分析：植物化学检测显示存在生物碱、黄酮类、酚类、甾体、皂苷、鞣质、花青素和木质素，其中酚类和黄酮类最为丰富。

3.3 C. vulgaris乙醇提取物中酚类和黄酮类化合物的HPLC分析：鉴定出四种酚类化合物（鞣花酸、对香豆酸、阿魏酸等）和五种黄酮类化合物（芦丁、木犀草素、芹菜素、儿茶素、槲皮素），含量以儿茶素最高（114.417 mg/mL）。

3.4 体外抗氧化活性评估：DPPH实验显示CV-SeNPs的IC₅₀为10.05 μg/mL，显著低于C. vulgaris（30.84 μg/mL）和游离SeNPs（60.88 μg/mL）。ABTS实验同样表明CV-SeNPs（IC₅₀=32.36 μg/mL）抗氧化能力最强。

3.5 体外抗菌活性：纸片扩散法显示CV-SeNPs对E. faecalis和S. aureus的抑菌圈直径分别为20 mm和16 mm，大于C. vulgaris和SeNPs。肉汤微量稀释法测定CV-SeNPs对70%的E. faecalis临床分离株MIC范围为128-1024 μg/mL，而C. vulgaris范围更窄（256-1024 μg/mL）。

3.6 体外抗生物膜活性：选取E. faecalis临床分离株E6，在1/8 MIC浓度下，CV-SeNPs使生物膜形成减少58.3%，显著优于C. vulgaris（p<0.01）和SeNPs（p<0.001）。

3.7 共聚焦激光扫描显微镜：CLSM双荧光染色显示，经1/8 MIC CV-SeNPs处理后，生物膜厚度减少56.25%，活细胞荧光强度显著降低（p<0.0001），死细胞荧光显著增加（p<0.001），细胞活力百分比显著下降。

3.8 伤口愈合和抗炎活性：MTT实验显示CV-SeNPs对WI-38细胞毒性最低，在16.25 μg/mL浓度下细胞活力为92.58%。体外划痕实验表明CV-SeNPs在48小时内显示出最快的伤口愈合速率。ELISA检测显示CV-SeNPs将TNF-α水平降低63.82%，IL-1β水平降低76.21%，显著优于单独C. vulgaris或SeNPs处理。

总结与结论：讨论部分指出，C. vulgaris乙醇提取物中的生物活性物质（黄酮类、酚类、皂苷、鞣质、生物碱等）赋予其显著的抗氧化、抗菌和抗炎特性。CV-SeNPs通过整合C. vulgaris的独特生物活性成分和SeNPs的纳米特性，实现多重协同效应：其抗氧化活性源于直接清除自由基以及诱导抗氧化酶（谷胱甘肽过氧化物酶GPx、过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD）活性；抗菌作用归因于小尺寸、高表面积和天然涂层，通过破坏细菌细胞膜、抑制代谢和产生ROS引起氧化应激；抗生物膜活性通过穿透和破坏胞外聚合物（EPS）基质、降低生物膜相关基因表达实现；伤口愈合促进与下调促炎细胞因子IL-1β和TNF-α、减少氧化应激以及C. vulgaris的植物刺激作用（促进血管生成、上皮化和纤维增生）相关。结论部分翻译如下：据研究人员所知，这是关于C. vulgaris和CV-SeNPs抗金黄色葡萄球菌（S. aureus）或粪肠球菌（E. faecalis）的抗菌和抗生物膜特性的首次报道。DPPH和ABTS自由基清除实验结果也证实了研究人员的研究发现，即C. vulgaris和CV-SeNPs具有显著的抗氧化活性。它们还表现出显著的抗炎活性，因为IL-1β和TNF-α的下调。此外，CV-SeNPs具有最高的伤口愈合率。基于CV-SeNPs的特殊性质，研究人员建议在抗菌和炎症控制领域对该配方进行更多研究。论文发表在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》。