《BioTech》：Rabbit Immune Cell Function: In Vitro Assays for Immunological Assessment Studies Using Flow Cytometry
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在啮齿动物长期研究中，反复采血具有挑战性且可能损害动物福利。兔（Oryctolagus cuniculus）因血容量较大、易于重复采样，是纵向研究的稳健替代模型。然而，评估兔免疫功能的标准化实验方法仍然稀缺。本研究提出了标准化且优化的基于流式细胞术（flow
在啮齿动物长期研究中，反复采血具有挑战性且可能损害动物福利。兔（Oryctolagus cuniculus）因血容量较大、易于重复采样，是纵向研究的稳健替代模型。然而，评估兔免疫功能的标准化实验方法仍然稀缺。本研究提出了标准化且优化的基于流式细胞术（flow cytometry）的实验方案，用于评估兔的氧化爆发（oxidative burst）、吞噬作用（phagocytosis）和淋巴细胞增殖（lymphocyte proliferation）。氧化爆发和吞噬活性使用DCFH（2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯，2′,7′-dichlorofluorescein diacetate）和荧光标记的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在肝素化全血中分析。淋巴细胞增殖在刀豆球蛋白A（ConA，concanavalin A）刺激的CFSE（5(6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯，5(6)-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester）标记的PBMC（外周血单个核细胞，peripheral blood mononuclear cells）中评估。流式细胞术（flow cytometry）分析实现了活性氧（ROS，reactive oxygen species）生成、吞噬摄取和CFSE稀释建模的同时定量。金黄色葡萄球菌刺激后，兔异嗜性粒细胞（heterophils）中位90.4%（IQR：84.8–92.9%）的门控细胞表现出ROS生成，中位吞噬摄取为23.6%（IQR：13.4–27.2%）。PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，phorbol 12-myristate 13-acetate）刺激细胞显示接近完全的氧化爆发（中位99.1%，IQR：98.7–99.5%），证实其功能类似于哺乳动物中性粒细胞。淋巴细胞对ConA刺激表现出可测量的增殖反应，验证了基于PBMC的实验方法用于适应性免疫评估。这些标准化方法为研究兔的先天和适应性免疫功能提供了框架，有助于免疫毒理学和安全评价研究。
研究背景与问题提出：在啮齿动物长期药效、安全性与毒理学研究中，反复采血困难且易破坏动物稳态，影响动物福利，也难以在不处死动物前提下获得多时间点足够血量。
兔因血容量大、可无创重复采血且不易产生严重不良反应，被视为纵向研究的合适替代模型。但现有评估多形核（PMN，polymorphonuclear）细胞功能（包括活性氧（ROS，reactive oxygen species）生成和吞噬活性）的标准化实验方案多为小鼠、人或其他物种设计；兔白细胞特别是免疫细胞功能的流式细胞术（flow cytometry）标准化评估方法稀缺，限制了兔在免疫毒理学（immunotoxicology）与安全评价中的应用。研究人员据此开展本研究，目的是建立并优化基于流式细胞术的兔外周血异嗜性粒细胞（heterophils，相当于哺乳动物的中性粒细胞neutrophils）氧化爆发（oxidative burst）、吞噬作用（phagocytosis）以及PBMC（外周血单个核细胞，peripheral blood mononuclear cells）淋巴细胞增殖（lymphocyte proliferation）的实验框架，为兔模型免疫稳态监测和化合物免疫调节效应识别提供可靠体外（in vitro）功能检测体系。论文发表在《BioTech》。
关键技术方法：研究人员使用20只6月龄雄性新西兰白兔（New Zealand White rabbits, Oryctolagus cuniculus）作为样本队列。氧化爆发与吞噬活性检测采用肝素化全血分别加入DCFH（2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯，2′,7′-dichlorofluorescein diacetate）联合pHrodo? Red标记的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，phorbol 12-myristate 13-acetate），37℃孵育后冷EDTA终止，ACK缓冲液裂解红细胞，流式分析。淋巴细胞增殖实验通过Ficoll-Paque?密度梯度离心分离PBMC，CFSE（5(6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯，5(6)-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester）标记后在RPMI-1640完全培养基中以ConA（刀豆球蛋白A，concanavalin A）刺激培养120 h，流式检测CFSE荧光稀释。所有流式数据用FlowJo?进行圈门（gating）与增殖建模（Proliferation Modeling），统计分析采用中位数与四分位距（IQR，interquartile range）描述。
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Results（结果）
3.1. Gating Strategy and Leukocyte Discrimination（圈门策略与白细胞区分）：研究人员发现兔红细胞对ACK裂解液敏感可在数分钟内选择性裂解而保留白细胞完整性，但仍存少量残留红细胞。采用前向散射（FSC，forward scatter）和对侧散射（SSC，side scatter）的对数标度较线性标度更能有效区分兔白细胞群体，尤其是异嗜性粒细胞（heterophils）与残存红细胞及碎片。通过对FSC-log/SSC-log点图圈定中等大小、较高颗粒度的集群作为PMN群体，排除碎片与残存红细胞。DCFH通道（FL-1，530 nm±15 nm）直方图显示未刺激时基线ROS水平低，PMA刺激后FL-1荧光强度显著右移，证实氧化爆发激活；FL-2（585 nm±21 nm）通道可区分吞噬了pHrodo? Red标记金黄色葡萄球菌的细胞。单染对照确认FL-1与FL-2间无光谱溢出，用于设定阳性阈值与象限门。金黄色葡萄球菌刺激条件下细胞分布于DCFH阳性与SA（Staphylococcus aureus）阳性各象限，反映同时发生ROS生成与细菌颗粒吞噬；PMA刺激细胞主要集中在Q3（DCFH+/SA?），符合无细菌颗粒时最大氧化爆发。
3.2. Oxidative Burst and Phagocytic Activity（氧化爆发与吞噬活性）：研究人员定量分析显示，金黄色葡萄球菌刺激后兔异嗜性粒细胞中位90.4%（IQR：84.8–92.9%）为DCFH阳性（Q2+Q3），中位SA阳性（吞噬细胞比例，Q1+Q2）为23.6%（IQR：13.4–27.2%）。PMA阳性对照中DCFH阳性中位99.1%（IQR：98.7–99.5%），SA阳性仅中位0.2%，符合PMA不引入细菌颗粒的预期。未刺激空白样本背景荧光极低（DCFH+中位3.5%，SA+中位0.1%），与补偿对照一致。结果表明兔异嗜性粒细胞功能完好，实验对照稳健。
3.3. Lymphocyte Proliferation（淋巴细胞增殖）：研究人员在PBMC培养后流式圈门时采用SSC阈值约400排除PMN，FSC范围200–800纳入增殖淋巴细胞并排除坏死小细胞碎片。FlowJo? Proliferation Modeling根据CFSE荧光直方图自动识别连续分裂峰。ConA刺激样本出现多个CFSE荧光依次减半的峰，代表多轮细胞分裂；未刺激对照以未分裂亲代峰为主。软件输出增殖指数（PI，proliferation index）、分裂指数（DI，division index）、分裂细胞百分比（PDC，percentage of divided cells）等定量指标。证明兔外周血淋巴细胞可对ConA产生明确增殖反应，CFSE稀释法适用于兔适应性免疫评估。
讨论部分总结：研究人员指出兔血细胞学特点不同于多数哺乳动物，循环以淋巴细胞为主、颗粒细胞较少，但异嗜性粒细胞（heterophils）在金黄色葡萄球菌刺激下仍显示强氧化爆发与吞噬能力，与文献中兔颗粒细胞抗微生物应答一致，且功能类比哺乳动物中性粒细胞（neutrophils），高DCFH阳性率（金黄色葡萄球菌后中位90.4%，PMA后中位99.1%）说明NADPH氧化酶依赖的ROS通路保守。吞噬阳性细胞比例低于氧化爆发比例，可能与颗粒内化与ROS生成的时序差异有关，类似马和小鼠颗粒细胞的流式研究报道。PBMC培养后ConA诱导淋巴细胞增殖表明兔外周血可支持适应性免疫体外评估。这些结果强化了兔作为免疫毒理学纵向研究模型的价值。局限性包括：PMN群体仅依靠FSC-log/SSC-log散射参数圈门，缺乏CD45等表面标志物或核染料（如SYTO），不能完全排除单核细胞污染；对数缩放致部分边缘事件（18–22%）可能丢失异嗜性粒细胞；氧化爆发、吞噬与120 h增殖培养均未用活/死判别染料（如fixable viability dye），死细胞或碎片可能非特异性结合DCFH或CFSE并增加自发荧光；未与同种实验条件下的其他物种直接并列比较，跨物种功能主张主要基于文献间接对比，存在实验室与仪器差异。讨论强调未来应引入泛白细胞标志、 viability dye及直接跨物种平行实验以提升严谨性。
结论部分翻译：在本研究中，研究人员提出了优化的基于流式细胞术的实验方案与分析流程，用于评估兔免疫功能反应，填补了免疫毒理学评估中的重要空白。兔异嗜性粒细胞表现出强且一致的氧化爆发与吞噬反应，定量数据在各条件每18只动物（剔除未达质量标准的样本后n=18）中得到验证。淋巴细胞增殖实验在ConA刺激后提供了可测量的CFSE稀释特征。进一步研究结合细胞因子谱与表面标志物表征可补充这些功能实验，从而在毒理或免疫调节条件下更全面理解兔免疫稳态。
