乳酰化修饰后水解乳清蛋白对肌蛋白合成的影响

《Food Production, Processing and Nutrition》：Effects of hydrolyzed whey protein after lactylation on muscle protein synthesis

　　

摘要：乳清蛋白作为一种天然复合物，在增强人体免疫力、抗癌、增肌、抗病毒、抗菌及改善肥胖方面已显现显著功效。然而作为完整蛋白质，长期连续补充可能给胃肠道带来负担。相比之下，乳酸修饰后的水解乳清蛋白仅需少量蛋白水解酶即可消化，对胰腺刺激极小，且比完整蛋白制品吸收更快。值得注意的是，与乳清蛋白相比，乳酸修饰后的水解乳清蛋白具有更高的亮氨酸(Leu)含量，可通过刺激C2C12肌细胞中p-S6K和m-TOR（应为mTOR）的表达来促进肌蛋白合成，该结论亦在动物及人体实验中得到证实。此外，研究人员在综合评估市场成本等因素后，对乳清蛋白与乳酸修饰后的水解乳清蛋白进行了梯度复配。结果表明，乳酸修饰后的水解乳清蛋白所占比例与C2C12细胞中肌蛋白合成的促进效果呈正相关，即便在10%添加量下亦可观察到显著差异。本研究将乳酰化(lactylated)乳清蛋白水解物定位为可刺激合成代谢信号的功能性营养素，为运动营养领域乳清蛋白市场产品创新不足的问题提供了一种潜在策略。

《Food Production, Processing and Nutrition》刊载论文解读——乳酰化修饰后水解乳清蛋白对肌蛋白合成的影响

一、研究背景与立项依据

乳清蛋白是干酪制作副产物中提取的优质全蛋白，含全部必需氨基酸且生物价高，在增强免疫力、改善体成分等方面应用广泛，但其热稳定性差、长期摄入易致胃肠负担，且现有改性手段多为单一改性，未能充分释放其在运动营养领域的促肌蛋白合成潜力。亮氨酸(Leucine, Leu)是激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target of Rapamycin, mTOR)信号通路、启动肌肉蛋白质合成(muscle Protein Synthesis, MPS)的关键启动因子，常规乳清蛋白虽富含Leu，但完整蛋白需经胃肠酶解才能释放活性肽与氨基酸。基于此，研究人员假设：先对乳清蛋白进行Alcalase 2.4L FG限制性酶解，再实施乳酸诱导的蛋白乳酰化(lactylation)，可获得小分子肽占比更高、Leu相对含量提升、胃肠耐受性好且能更强激活mTORC1→p-S6K通路的改性产物（编号为wpel，商品名Z?Power?），并通过细胞、动物及人体试验系统验证其促合成效能，为运动营养配方升级提供实验依据。

二、主要关键技术方法

研究人员以普通乳清蛋白(con)、单纯酶解乳清蛋白(wpe)、先乳酰化后酶解产物(wple)及酶解后乳酰化产物(wpel，即受试物)为样本，测定基础理化和氨基酸组成；采用INFOGEST国际共识静态体外胃肠消化模型模拟成人消化，结合Ussing腔室测定肠侧/浆膜侧Leu表观吸收率；以C2C12小鼠成肌细胞为模型，经分化诱导后用抗快肌肌球蛋白(myosin?fast)免疫荧光观察肌管融合与直径，Western blot检测磷酸化mTOR(p?mTOR)与p70S6激酶(p?S6K)；选用雄性C57BL/6小鼠随机分为生理盐水对照、单纯乳清蛋白(800 mg/kg/d)、乳清蛋白:wpel=10:1及5:1三个剂量组，灌胃10周后取腓肠肌(GAS)、胫骨前肌(TA)、比目鱼肌(SOL)称质量并行H&E染色与Western blot；招募≥30岁健康成人12名（男女各半）开展90天随机对照试验，干预为单纯乳清蛋白或乳清蛋白添加10% wpel（800 mg/kg/d），动态监测BMI、握力、四肢骨骼肌量、体脂率及瘦体重。

三、研究结果

Effects of single modification on basic properties of whey protein（单一化学修饰对乳清蛋白基本理化性质的影响）

通过对乳清蛋白分别进行乳酰化(wpl)、柠檬酸化(wpc)、葡糖基化(wpg)、茶多酚偶联(wptp)修饰，测定保水性(WHC)、持油性(OHC)及溶解度。研究发现wpg保水性最高，wpl持油性最高；wpg因葡糖基化诱导蛋白交联聚合致溶解度显著下降，其余单修饰对溶解度影响不显著，表明不同共价修饰可定向改善特定加工功能特性。

Effects of the combination between enzymatic hydrolysis and lactylation modification on whey protein（酶解与乳酰化联合修饰对乳清蛋白组分的影响）

酶解显著提高酸溶蛋白与短肽(<3 kDa)含量；wpel（先酶解后乳酰化）较con及单纯酶解(wpe)肽段更丰富，且水解氨基酸分析显示wpel中Leu含量较con升高近20%，为后续激活Leu?mTOR轴奠定生化基础；先乳酰化后酶解(wple)因乳酰化致蛋白聚集遮蔽酶切位点，小分子肽增量不及wpel。

Peptides distribution after gastrointestinal digestion and the apparent rate of Leu（胃肠消化后肽分布及Leu表观吸收率）*

体外胃肠消化后，wpel低分子量肽(<500 Da)比例高于con且对进一步酶解有抵抗性；Ussing腔实验显示wpel消化液中Leu从小肠腔向浆膜侧转运量达78.69 mg/g，表观吸收率显著高于con、wpe及wple，提示其肽谱有利于Leu的高效跨膜吸收。

Effects of wpel on promoting muscle protein synthesis in C2C12 cells（wpel对C2C12细胞肌蛋白合成的促进作用）

与con及wpe相比，wpel处理组肌管MyHC免疫荧光染色绿色区域更广，肌管融合指数与平均直径显著增加；Western blot示wpel上调p?mTOR及p?S6K蛋白表达水平（灰度扫描证实），表明wpel通过激活mTORC1→S6K信号促进成肌分化与MPS；梯度添加实验显示wpel占总量10%时即与对照组出现显著差异，且随比例升高效应增强。

Effects of wpel on promoting muscle protein synthesis in animals（wpel对小鼠骨骼肌合成的促进作用）

灌胃干预10周后，各蛋白干预组GAS、TA、SOL湿重均高于生理盐水对照，其中添加wpel的5:1与10:1组优于单纯乳清蛋白组；GAS组织H&E染色见wpel组肌纤维横截面积增大、排列紧密、圆形度降低；骨骼肌p?mTOR与p?S6K蛋白表达呈wpel剂量依赖性上调（5:1组p?mTOR磷酸化水平显著高于单纯wpel及10:1组，p<0.05；p?S6K三组干预间无显著差异但均高于对照），证实体内同样可通过mTOR/S6K通路增效MPS。

Effects of wpel supplementation on basic anthropometric parameters and physiological?biochemical markers in participants（wpel补充对人体体质参数及相关指标的影响）

90天干预显示，添加10% wpel组较单纯乳清蛋白组在握力、四肢骨骼肌量、瘦体重方面提升更明显，BMI与体脂率改善呈时间正相关，说明wpel在人体中较传统乳清蛋白更能提升骨骼肌量与质量。

四、讨论与结论翻译

现有研究表明乳清蛋白富含生物活性成分，但诸多活性隐匿于天然序列中需酶解为肽方激活；常规水解乳清蛋白(HWP)虽吸收快、致敏性低，但产技受限且多用于降压、调糖，未深耕运动营养促合成场景。本研究制得之wpel（先Alcalase酶解再乳酰化）小分子肽(<1000 Da)显著增多，乳酰基修饰掩苦并诱导构象重排，体外消化耐受性强，Leu含量升约20%、Ussing腔证实Leu表观通透率高；Leu于肌组织转氨生成谷氨酰胺协同激活mTOR，触发合成代谢级联。C2C12细胞、小鼠及人体试验一致证明wpel可增肌管融合/直径、上调p?mTOR/p?S6K、增肌质量与人体握力/瘦体重，且10%复配量即有统计学差异。

结论（译自Conclusion段）：

乳清蛋白具高保水性及优良乳化特性，广泛用于焙烤、酸奶及冰淇淋，但其多数生物活性需经酶解活化。水解乳清蛋白(HWP)分子量介于氨基酸与完整蛋白间，生物活性与功能性更优，消化快、致敏低，然现有技术多聚焦降压、调糖及认知改善，难满足大健康产业升级需求。为此研究人员开发了专用于快速激发肌蛋白合成的乳酰化后水解乳清蛋白(wpel)。wpel经酶解—乳酰化处理，显著富集<1000 Da肽段，乳酸修饰兼掩苦味并促蛋白重排，体外消化稳定性好；氨基酸谱示Leu升约20%，Ussing腔证实其高表观通透率。Leu激活肌细胞mTOR，触发合成代谢信号——此与本结果吻合：wpel显著提升C2C12肌管融合率与直径，上调p?mTOR及p?S6K表达，该效应在动物及人体临床试验中获验证；剂量—效应研究显示，相较等剂量普通乳清蛋白，仅添加10% wpel即产生显著促肌合成效果。wpel在增强肌蛋白合成方面的潜力为其应用于运动营养提供科学依据，后续需在运动/运动后范式下评估急性MPS及体能表现，并进一步阐明Leu升高机制、优化感官与纯化工艺。