《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Elevated maternal non-esterified fatty acid concentrations during late gestation are associated with altered skeletal muscle development and mitochondrial dynamics related-markers in calves
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背景：晚期妊娠是胎儿骨骼肌形成的重要窗口期，与子代出生后体格生长、代谢健康及运动能力相关。尽管经产奶牛围产期循环非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acid, NEFA）升高与泌乳性能的关系已被广泛研究，但其与胎儿及新生犊牛骨骼肌发育的关联
背景：晚期妊娠是胎儿骨骼肌形成的重要窗口期，与子代出生后体格生长、代谢健康及运动能力相关。尽管经产奶牛围产期循环非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acid, NEFA）升高与泌乳性能的关系已被广泛研究，但其与胎儿及新生犊牛骨骼肌发育的关联尚不清楚。方法：研究人员将60头体况、胎次及预产期相近的健康荷斯坦（Holstein）奶牛于干奶后按干奶期第1、3、5、7周血清NEFA均值分为低NEFA组（n＝30，263±8.8 μmol/L）和高NEFA组（n＝30，379±9.1 μmol/L），采集犊牛出生当日及1月龄股二头肌（biceps femoris）、半腱肌（semitendinosus）与股直肌（rectus femoris），评估子代肌肉质量、肌纤维形态及代谢功能；并采用C2C12成肌细胞体外添加NEFA观察其对成肌分化的影响。结果：干奶期母牛NEFA处于生理范围内偏高水平不影响犊牛出生体重（P＝0.15），但使犊牛股二头肌（P＝0.05）与半腱肌质量（P＜0.01）降低；高NEFA组犊牛骨骼肌快肌纤维（fast-twitch fiber）比例下降（P＜0.01）、慢肌纤维（slow-twitch fiber）比例升高（P＝0.01）；犊牛骨骼肌中线粒体分裂相关标志物动力蛋白相关蛋白1（dynamin-related protein 1, DRP1）与线粒体裂变蛋白1（fission protein 1, FIS1）及干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes, STING）相关炎症标志物蛋白丰度升高（P＜0.01），该改变在1月龄时仍持续存在。体外实验中，NEFA处理降低成肌分化与快肌纤维形成（P＜0.01），同时上调线粒体动力学相关基因与炎症标志物表达（P＜0.01）。结论：干奶期母牛NEFA升高与所产犊牛骨骼肌发育改变及线粒体动力学与炎症相关标志物表达变化相关。
本研究发表于《Journal of Animal Science and Biotechnology》，围绕干奶期（dry period）荷斯坦（Holstein）奶牛血清非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acid, NEFA）水平是否处于生理正常偏高范围即可通过胎儿编程（fetal programming）影响新生及早期犊牛骨骼肌发育、肌纤维类型组成及线粒体动力学与相关炎症信号通路展开探讨。目前已知围产期奶牛NEFA升高与酮病、脂肪肝等母体代谢疾病关系密切，但NEFA在生理范围内波动是否足以影响胎儿骨骼肌肌纤维发生（myogenesis）、肌纤维类型转换及线粒体分裂（mitochondrial fission）/融合平衡与STING（stimulator of interferon genes）信号尚缺乏直接证据。为此，研究人员设计临床队列结合体外成肌细胞模型，发现干奶期母牛NEFA适度升高即与犊牛特定后肢肌肉质量降低、快肌纤维（fast-twitch/myosin heavy chain 1, MYH1阳性）占比减少、慢肌纤维（slow-twitch/MYH7阳性）占比增加，以及骨骼肌中DRP1（dynamin-related protein 1）、FIS1（mitochondrial fission protein 1）与STING–TBK1（TANK-binding kinase 1）通路相关分子表达上调相偶联，提示母体轻度脂解增强可通过胎儿源机制重塑子代肌肉表型与线粒体应激/炎症基调。
主要关键技术方法：研究人员选取60头体况、胎次、预产期相近的健康怀孕Holstein奶牛，干奶后第1、3、5、7周采血测血清NEFA并以群体均值为界中位分组（低NEFA组 DL-NEFA <323.5 μmol/L，高NEFA组 DH-NEFA ≥323.5 μmol/L）；收集所产雄性犊牛（n=15/组）出生即刻与1月龄屠宰取材股二头肌、半腱肌、股直肌称质量并做石蜡切片；采用苏木精–伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色测肌纤维横截面积，免疫荧光标记MYH1与MYH7区分快/慢肌纤维比例，实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）检测线粒体动力学及核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）亚基RELA等mRNA，蛋白质免疫印迹（Western blot）检测DRP1、FIS1、STING、TBK1蛋白；体外用C2C12小鼠成肌细胞诱导分化并添加不同浓度NEFA（0、100、200 μmol/L），通过Desmin免疫荧光、qPCR及Western blot评估成肌分化、肌纤维类型标志基因及线粒体/炎症相关分子表达。
研究结果归纳如下：
Body conditions in dry cows and birth weight in calves：干奶期DH-NEFA组母牛血清NEFA持续高于DL-NEFA组（379±9.1 vs 263±8.8 μmol/L，P<0.01），两组β-羟丁酸（β-hydroxybutyrate, BHB）、葡萄糖、胰岛素、干物质采食量（dry matter intake, DMI）、体重及体况评分（body condition score, BCS）无差异，排除明显能量负平衡或酮病干扰；DH-NEFA组新生犊牛血清NEFA亦高于DL-NEFA组（P=0.03），但犊牛出生体重、体高（withers height）、体斜长（body length）无显著差异（P>0.05）。
Skeletal muscle development and mitochondrial dynamics-related molecular alterations in calves at birth：DH-NEFA组新生犊牛股二头肌（P=0.05）与半腱肌（P<0.01）质量低于DL-NEFA组，股直肌无差异；股二头肌H&E示肌纤维横截面积减小，MYH1+快肌纤维面积比降低9.45%（P<0.01），MYH7+慢肌纤维面积比升高5.35%（P=0.01）；qPCR显示线粒体动力学相关基因MFN1（mitofusin 1）、FIS1、DRP1（DNM1L）、NRF1（nuclear respiratory factor 1）、NRF2（NF-E2-related factor 2）、促凋亡BAX显著上调（P<0.01），Western blot示DRP1与FIS1蛋白丰度升高，STING蛋白及RELA（编码NF-κB p65）mRNA上调（P<0.01）。
Muscle fiber growth and mitochondrial dynamics-related molecular alterations in one-month-old calves：至1月龄，DH-NEFA组犊牛体重、体高、体斜长仍与对照组无差异，但三个后肢肌肉（股二头肌、半腱肌、股直肌）质量均低于DL-NEFA组（P<0.01）；股二头肌肌纤维横截面积减小10.4%（P<0.01），慢肌纤维比例持续偏高（P<0.01）；qPCR示MFN1、FIS1、DRP1、NRF1、NRF2、BAX与RELA上调（P<0.01），Western blot示FIS1（P<0.01）与TBK1（P=0.02）蛋白升高，STING蛋白与出生时相比无差异（P=0.26）。
Effects of NEFA supplementation on myogenic differentiation and mitochondrial dynamics-related gene expression in vitro：C2C12成肌诱导分化期添加100或200 μmol/L NEFA使Desmin阳性成熟肌管形成减少（P<0.01），快肌调控基因Myh1、Myh2、Myh4下调（P<0.01）；线粒体分裂基因Fis1、Dnm1l、Nrf1、Nfe2l2及炎症调节基因Nfkb1上调（P<0.01），Western blot示DRP1、FIS1、STING与TBK1蛋白丰度升高（P<0.01），再现体内表型。
讨论部分总结：研究人员指出即使母牛干奶期NEFA处于生理正常范围上限（未达酮病阈值），仍可通过胎儿编程影响子代骨骼肌发育，表现为特定肌肉质量降低、肌纤维由快向慢类型偏移及线粒体分裂与STING–TBK1–NF-κB相关炎症信号激活，体外C2C12模型支持NEFA直接抑制成肌分化并诱导上述分子改变；该效应不伴随整体体格生长受阻，提示骨骼肌是对母体轻度脂解敏感的靶组织。作者认为多不饱和长链脂肪酸较饱和脂肪酸更易经胎盘传递从而介导上述效应。研究局限包括未直接测定线粒体呼吸功能、未能完全排除血糖/氨基酸/其他炎症介质协同作用及因果推断受观察性设计限制，未来可关注mTOR（mechanistic target of rapamycin）、Hippo通路及miRNA在母源代谢应激对胎儿肌肉重编程中的作用。
结论部分原文意译：综上所述，本研究表明干奶期母牛NEFA水平升高（仍处于围产期生理范围）所产犊牛虽无出生体重差异，但出现骨骼肌发育改变，表现为后肢部分肌肉质量降低、肌纤维类型由快向慢偏移，以及骨骼肌中线粒体分裂相关蛋白DRP1、FIS1与STING关联炎症标志物表达上调；该结果强调干奶期充足能量供给与代谢稳态对子代犊牛产前及出生后健康肌肉发育的重要性。
