筋膜外植体实现活体组织中伤口成纤维细胞谱系的实时动态研究

《BMC Methods》：Fascia explants enable real-time dynamic studies of wound fibroblast ancestry in living tissues

　　

背景：异常的伤口愈合是许多纤维化疾病和术后并发症的根源，理解其机制将增加治疗选择。哺乳动物的伤口愈合由专门的伤口成纤维细胞负责，这些细胞源于筋膜结缔组织，并驱动炎症、瘢痕形成和组织收缩。实时监测深筋膜中这些伤口成纤维细胞前体的活动在实验动物中一直具有挑战性。在此，研究人员分离筋膜层并将其自由漂浮培养在细胞培养皿中，以分析炎症、瘢痕形成和收缩的因果事件。方法：在该筋膜外植体（FE）系统中，伤口成纤维细胞前体可在其天然活体微环境中被系统性地探究。FE是直径约4 mm的漂浮筋膜组织外植体，可培养最多7天，从而得以研究成纤维细胞前体分化以引起促炎症、结缔组织收缩和瘢痕样组织形成的过程。该系统具有高度的多功能性和可扩展性，并可与其他细胞类型（例如免疫细胞）共培养，以进行化学筛选来探究伤口修复过程的各个方面。讨论：本方案为研究人员探索伤口修复的关键机制提供了一个有价值的工具，使得能够直接评估药物对愈合结果的影响，并增进对成纤维细胞动态及其与复杂组织环境相互作用的理解。

本研究聚焦于伤口愈合中成纤维细胞动态的实时可视化难题。异常伤口愈合是多种纤维化疾病与术后并发症的根源，而哺乳动物的伤口修复主要由源自筋膜结缔组织的专门成纤维细胞驱动，这些细胞依次经历促炎、收缩和瘢痕诱导等分化阶段，最终完成组织关闭。然而，现有体内实验受伦理与技术限制，难以长期追踪深筋膜中成纤维细胞前体的行为；体外模型或人工皮肤等效物无法忠实再现结缔组织的复杂微环境，也缺乏可视化成纤维细胞分化和组织收缩顺序过程的能力。此外，现有系统与异细胞共培养模式不兼容，限制了免疫-成纤维细胞互作的研究。为突破这些瓶颈，研究人员开发了一种离体筋膜外植体（Fascia Explant, FE）培养系统。该系统从小鼠或人类背部皮肤中精确分离筋膜层，切取约4 mm²的外植体，在含血清的DMEM培养基中自由漂浮培养，可维持至多7天。培养期间，外植体逐渐收缩至初始面积约50%，形成致密不透明的瘢痕样结构，重现了体内伤口收缩的关键特征。该论文发表于《BMC Methods》，为伤口修复机制探索提供了直接、高通量的实验平台，并验证了其在不同生理状态（年轻、老年、糖尿病）样本及药物筛选中的适用性，显著推进了对成纤维细胞动态及其与组织微环境互作的理解。

**主要关键技术方法概括（不超过250字）**
研究人员采用的手术分离与离体培养技术：从小鼠（任何年龄、性别或遗传品系，包括Engrailed-1 Cre报告小鼠）或人类供体背部皮肤中，小心剥离浅筋膜层，避免混入脂肪或肌肉；使用无菌器械切取约4 mm直径的筋膜外植体，置于6孔板（每孔3 ml完全DMEM/F12培养基）中自由漂浮，于37°C、5% CO₂、21% O₂条件下培养最长7天，每2天换液。通过每天明场成像记录组织收缩面积变化，培养结束时用2%多聚甲醛固定，蔗糖脱水后OCT包埋，冷冻切片（6–7 μm），进行免疫荧光染色（如PDPN、αSMA）以鉴定成纤维细胞分化状态。通过添加化合物（如TGFβ、YAP抑制剂Verteporfin）或中和抗体进行功能筛选，也可与免疫细胞共培养。

**研究结果**
1. **组织收缩的实时可视化**：通过每日明场成像，FE系统清晰展示了筋膜外植体从分离时的半透明胶状结构逐渐收缩为致密不透明团块的过程；定量分析显示，外植体面积随时间线性减小，至第6天达稳定状态，表明该系统能够动态监测组织收缩。
2. **成纤维细胞分化状态的时空分析**：免疫荧光染色揭示，培养第3天时外植体内部细胞以促炎表型为主导（高表达Podoplanin, PDPN），而收缩标志物α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达有限；至第6天，多数成纤维细胞转化为αSMA⁺肌成纤维细胞，PDPN⁺群体显著减少，此时间顺序与体内伤口愈合动力学一致。
3. **不同生理条件下收缩动力学比较**：从年轻、老年和糖尿病小鼠来源的FE表现出差异化的收缩曲线。年轻样本收缩迅速且幅度大，而老年和糖尿病样本的收缩能力降低或出现异常，说明外植体保留了原组织的环境依赖性特征。
4. **信号通路调节剂对收缩的影响**：在FE培养基中添加转化生长因子β（TGFβ）显著加速组织收缩；而加入YAP抑制剂Verteporfin则完全阻止收缩。相比之下，对照组显示中度收缩，证明该体系可用于量化筛选影响伤口修复的药物或抗体。
5. **人类筋膜外植体的适应性**：人类皮肤来源的FE在相同培养条件下同样发生时间依赖性收缩（从第0天至第10天），表明该系统跨物种普适，适合转化研究。

**讨论与结论**
讨论部分指出，FE系统弥补了现有模型在微环境保真度和异细胞共培养方面的不足：其简单高效，能直接提供组织收缩和成纤维细胞分化的功能读数；可与中性粒细胞、单核/巨噬细胞共培养，便于研究免疫-成纤维细胞互作。注意事项包括：需彻底去除毛发和血液残留以避免干扰；换液时保留100 μl旧培养基以防外植体被吸走；当前采用常氧（21% O₂）条件，未来可引入低氧环境以模拟皮下生理氧张力。研究结论可总结为：FE培养系统是一种独特的方法，能够以简单高效的方式实时可视化筋膜组织收缩，并识别影响伤口修复速率和愈合结局的新型化合物、中和抗体、候选药物或病毒，为纤维化疾病研究与治疗开发提供了重要工具。