基于亲和肽（Affibody）互补位遮蔽的工程化条件活性西妥昔单抗前药

《Journal of Biological Engineering》：Engineering a conditionally active cetuximab prodrug via affibody-based paratope masking

　　

单克隆抗体作为靶向药物的应用已革新了肿瘤治疗领域，但其疗效有时因靶点在健康组织中表达而产生的毒性而受到限制。多种策略已被开发以克服这些问题，其中包括抗体前药的设计。本研究报道了一种基于亲和肽（affibody）的遮蔽结构域的构建，该结构域能够特异性结合并遮蔽抗表皮生长因子受体（EGFR）抗体西妥昔单抗（cetuximab）的互补位（paratope）。研究人员利用亲和肽文库的细菌展示（bacterial display）和细胞分选技术筛选合适的候选分子。实验与计算分析共同证实，筛选出的数种亲和肽能够有效阻断西妥昔单抗与EGFR的结合。研究人员将最具前景的遮蔽候选分子融合至抗体重链，构建了西妥昔单抗前药。该前药在体外呈现遮蔽态与非遮蔽态之间超过400倍的生长抑制效应差异。比较西妥昔单抗与其前药分布特征的小鼠体内生物分布研究表明，在异种移植瘤模型中实现了西妥昔单抗前 expired.

该研究论文发表于《Journal of Biological Engineering》，旨在解决单克隆抗体治疗中存在的"靶向毒性"（on-target, off-tumor toxicity）问题，即抗体无法区分肿瘤组织与正常组织中低水平表达的相同靶抗原，导致全身性不良反应。以西妥昔单抗为例，该抗EGFR抗体虽对转移性结直肠癌和头颈部鳞状细胞癌具有明确疗效，但因其靶点EGFR在皮肤、肝脏和胃肠道等正常组织中丰度表达，高达90%的患者会出现皮肤毒性反应，严重影响生活质量并可能导致减量或停药。为此，研究人员开发了基于亲和肽遮蔽结构域的蛋白酶激活型抗体前药，使抗体在循环中保持失活状态，仅在肿瘤微环境中通过肿瘤相关蛋白酶切去除遮蔽结构，恢复抗原结合能力，从而提高治疗指数。

该研究主要采用了以下关键技术方法：基于大肠杆菌展示的亲和肽组合文库筛选技术（文库多样性约10¹¹），结合磁激活细胞分选（MACS）与荧光激活细胞分选（FACS）进行多轮筛选；利用AlphaFold3进行蛋白质结构预测；通过表面等离子体共振（SPR）分析结合动力学；采用流式细胞术评估细胞结合与遮蔽效率；构建含蛋白酶可切割链接子的基因工程抗体前药，并于ExpiCHO细胞系统中重组表达；运用¹¹¹In放射性核素标记进行小动物正电子发射断层显像（PET）生物分布研究；选取表达不同水平EGFR及肿瘤相关蛋白酶的H292（人肺黏液表皮样癌）和FaDu（人下咽鳞状细胞癌）细胞系及相应小鼠异种移植瘤模型进行体内外功能验证。

研究结果部分按以下层次展开：

**MACS与FACS筛选西妥昔单抗结合亲和肽**：研究人员构建了多样性约10¹¹的亲和肽文库，通过大肠杆菌展示系统进行筛选。先以IgG-mix包被磁珠及裸磁珠进行两轮负选以去除非特异性结合分子，再以西妥昔单抗包被磁珠进行正选，经两轮MACS后文库多样性降至约10⁵。随后进行三轮FACS，逐步降低西妥昔单抗浓度以提高筛选严格性，末轮加入37°C、3小时的解离步骤以富集慢解离速率克隆。流式分析显示各轮分选输出中结合西妥昔单抗的克隆逐步富集。

**单克隆候选分子流式细胞术分析**：从FACS输出中随机挑取单克隆，通过高通量双标记流式检测评估各候选分子的遮蔽能力——比较其与单独西妥昔单抗或西妥昔单抗-EGFR复合物的结合差异。结果显示大多数候选分子能结合西妥昔单抗并与EGFR竞争重叠表位，其中Zcet-1和Zcet-2表现出显著遮蔽能力。

**文库深度测序**：对原始文库及FACS第2、3轮和 off-rate选择输出进行深度结果深度测序。成对序列相似性分析显示前7条富集序列在可变区具有超过70%的相似性。Zcet-1和Zcet-2在最终分选库中分别占41.8%和22.8%，另选取丰度较低的Zcet-6（0.3%）作为对照比较。

**复合物结构模型预测**：利用AlphaFold3预测Zcet-1、Zcet-2、Zcet-6与西妥昔单抗Fab可变区的复合物结构。预测模型显示三种亲和肽均与西妥昔单抗互补位决定区（CDRs）内的EGFR识别位点重叠竞争，界面pTM分数0.81-0.92，支持其遮蔽作用的结构基础。

**二级结构、热稳定性及结合动力学分析**：圆二色谱（CD）检测显示Zcet-1、Zcet-2、Zcet-6的熔解温度（Tm）分别为50°C、36°C和32°C，均呈α-螺旋结构且热变性后可复性。SPR分析显示三种亲和肽与西妥昔单抗的平衡解离常数（K_D）在26.3-46.3 nM范围，具有快速结合-解离动力学特征。

**SPR和流式细胞术评估遮蔽能力**：SPR竞争性实验证实Zcet-1、Zcet-2、Zcet-6能有效阻断西妥昔单抗与EGFR的结合，而Fc结合亲和肽Zwt无此作用。流式细胞术显示Zcet-1使西妥昔单抗对H292细胞的EC₅₀从0.11 nM升至3.8 nM，遮蔽倍数达34倍。

**西妥昔单抗前药的生产与表征**：将Zcet-1通过含G4S重复序列的链接子融合于西妥昔单抗重链N端，构建含1、2或3个G4S重复的前药变体。流式分析显示三种链接子长度均实现有效遮蔽，无显著差异。选择最长链接子（3×G4S）并引入基质金属蛋白酶（matriptase）底物序列（LSGRSDNH）的构建体进行后续研究。nanoDSF显示前药与未修饰西妥昔单抗热稳定性相当。重组matriptase处理可切割链接子释放遮蔽结构。前药完整态对H292细胞的结合EC₅₀为6.60±0.74 nM，较切割态（0.12±0.01 nM）增高55倍。

**细胞生长抑制实验**：H292细胞中，完整前药的IC₅₀为79.3±14 nM，而非切割对照为59.9±17 nM，西妥昔单抗为0.08±0.03 nM，切割后前药为0.19±0.12 nM，完整前药较切割态IC₅₀增高超过400倍，遮蔽因子约417。

**荧光显微镜检测**：在H292、FaDu、HaCaT（永生化人角质形成细胞，高表达EGFR）和A431（人表皮样癌，高表达EGFR）四种细胞系中，完整前药均有效遮蔽EGFR结合，蛋白酶处理后恢复结合；非特异性亲和肽对照（Dummy masking）几乎不影响结合，证实特异性遮蔽相互作用的必要性。

**放射性标记抗体的结合特异性、球体实验及生物分布研究**：¹¹¹In标记的西妥昔单抗和SSERT前药放射化学纯度均>96%。H292和FaDu单层细胞结合特异性实验中，过量非标记西妥昔单抗预孵育可显著降低¹¹¹In-西妥昔单抗细胞结合；前药细胞结合较西妥昔单抗低约17倍。24小时内在化实验显示慢内化特征，约10%细胞相关活性内化。H292球体中前药结合较FaDu球体高2倍，提示H292模型中存在前药激活。体内生物分布研究显示，H292移植瘤中¹¹¹In-前药摄取为西妥昔单抗对照的57±8%，而FaDu移植瘤中仅32±11%（p=0.0106），支持matriptase介导的肿瘤特异性前药激活。

讨论与研究结论部分，研究人员指出该研究首次将亲和肽作为遮蔽结构域用于全抗体前药构建。大肠杆菌展示平台不仅适用于高通量筛选，还可直接用于遮蔽功能的高通量评估。AlphaFold3结构预测、CD光谱、SPR动力学及热稳定性分析等多维表征共同支持Zcet-1作为最优候选。前药设计采用模块化的蛋白酶可切割链接子策略，通过matriptase底物实现肿瘤微环境响应性激活。虽然体外单层H292细胞中未观察到前药自发激活（与文献报道该细胞系matriptase表达水平不足以在单层培养中激活前药一致），但三维球体及小鼠异种移植瘤模型中检测到推测性激活信号，差异归因于H292较FaDu具有更高的matriptase活性。

研究人员在结论中明确指出：成功建立了一种大肠杆菌展示系统，用于特异性抗体遮蔽结构域的发现和高通量表征；Zcet-1作为最具前景的候选分子，整合入西妥昔单抗前药后，体外功能活性降低超过400倍；生物分布结果证实了新发现遮蔽结构域的体内遮蔽能力，并提示matriptase介导的前药激活；体外和体内数据支持基于亲和肽的遮蔽结构域调控治疗性抗体活性的潜力，为降低系统性毒性同时保持疗效提供了灵活且模块化的策略；该工作开辟了开发用于精准肿瘤治疗的新一代前药的新途径。未来研究方向包括优化更高效的多蛋白酶响应链接子、评估完整与切割抗体物种在系统循环中的稳定性，以及在不同肿瘤模型中验证该策略的普适性。