《Veterinary Research》：Development and characterization of functional sheep endometrial luminal epithelial organoids
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腔上皮（luminal epithelium, LE）是胚胎–母体（embryo–maternal）通讯的主要界面。在反刍动物（如绵羊）中，LE调控非侵入性黏附、胚泡（conceptus）延伸及妊娠识别等关键生殖事件。现有模型存在明显局限：传统二维（two-d
腔上皮（luminal epithelium, LE）是胚胎–母体（embryo–maternal）通讯的主要界面。在反刍动物（如绵羊）中，LE调控非侵入性黏附、胚泡（conceptus）延伸及妊娠识别等关键生殖事件。现有模型存在明显局限：传统二维（two-dimensional, 2D）培养无法重现子宫内膜复杂性，而现有类器官（organoid）体系主要来源于腺上皮（glandular epithelium）。本研究报道了利用含CHIR99021、Y-27632、SB202190及EphrinA1配体的优化扩增培养基（expansion medium, ExM），建立稳健的三维（three-dimensional, 3D）绵羊子宫内膜腔上皮类器官培养体系。所得类器官具备典型LE特征：极化结构、黏液（mucin）分泌及高表达谱系标志物——角蛋白18（keratin 18, KRT-18）、滋养层细胞表面抗原2（trophoblast cell surface antigen 2, TROP2）及上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）。研究人员还建立了顶膜朝外（apical-out）极性模型，忠实重现体内LE朝向。转录组分析证实类器官与原位LE高度相似且保留激素反应性。功能验证显示类器官在共培养体系中能促进囊胚（blastocyst）扩展及滋养层（trophoblast）增殖，并在β-雌二醇（β-estradiol, E2）＋醋酸甲羟孕酮（medroxyprogesterone acetate, MPA）处理后增强底物特异性黏附。值得注意的是，研究人员发现红细胞生成素产生肝细胞受体A（erythropoietin-producing hepatocellular receptor A, EphA）信号是类器官发育过程中干性（stemness）属性的新型调控因子。综上，功能性腔上皮类器官的成功建立提供了可模拟原位子宫内膜结构、激素反应及胚胎互作的生理相关模型，为研究子宫内膜容受性（endometrial receptivity）机制及筛选提高反刍动物繁殖效率的药物提供了有价值平台。
绵羊子宫内膜腔上皮类器官（LE organoids）的建立、表征及其在胚胎–母体互作研究中的应用解读
一、研究背景与立项依据
子宫腔上皮（luminal epithelium, LE）是胚胎植入期胚胎与母体首次接触的关键界面，在反刍动物中负责调控非侵入性胚胎黏附、胚泡延伸及干扰素τ（IFN-τ）介导的妊娠识别。传统二维（2D）单层培养无法重建三维（3D）微环境且原代细胞易衰老、丧失激素反应性；已有子宫内膜类器官多源自腺上皮（glandular epithelium, GE），缺乏纯LE来源的类器官模型。绵羊子宫肉阜（caruncle）区域天然无腺体结构，为分离高纯度LE细胞提供了独特优势。因此，研究人员旨在建立绵羊LE来源的功能性3D类器官，系统验证其形态、分子、激素响应及胚胎互作功能，弥补现有模型缺陷。
二、主要关键技术方法
研究人员从发情期中国湖羊（Chinese Hu ewes, N=3头，生物学独立重复）子宫角肉阜（caruncle）分离LE细胞，经胶原酶Ⅰ/透明质酸酶/DNaseⅠ消化后包埋于Matrigel中进行3D培养；采用含WNT激动剂CHIR99021、ROCK抑制剂Y-27632、p38 MAPK抑制剂SB202190及EphrinA1-Fc的优化扩增培养基（ExM）进行长期传代；通过悬浮超低吸附板培养实现顶膜朝外（apical-out）极性反转；利用H&E、PAS染色、透射电镜（TEM）、免疫荧光（IF）检测KRT-18/EpCAM/TROP2/ZO-1（zonula occludens-1）/FOXA2等标志物；通过bulk RNA-seq比对单细胞RNA-seq（scRNA-seq）构建的原位LE伪 bulk转录组评估相似性；采用非接触共培养评估类器官条件培养基对体外受精囊胚扩展的影响，Transwell间接共培养评估对滋养层细胞周期的影响；以E2、MPA及IFN-τ处理检测激素响应基因（PGR、SPP1、MUC1、TGFB1等）的qRT-PCR与Western blot；通过底物黏附实验（滋养层单层/基质细胞单层/纤连蛋白fn-coated板）评估黏附能力。
三、研究结果
优化培养体系与扩增培养基筛选
研究人员以基础子宫内膜类器官培养基为底板，系统筛选9种含/不含CHIR99021、Y-27632、SB202190及EphrinA1-Fc的组合，发现四者联用（ExM）显著提高类器官形成效率（organoid formation efficiency, OFE）与直径（＞100 μm）；撤除EGF/Noggin/FGF10/A83-01/HGF显著降低直径，撤除R-spondin-1（RSPO1）无显著影响；ExM支持稳定传代至第8代仍保持Ki-67阳性增殖能力。
绵羊子宫内膜腔上皮类器官的表型与分子鉴定
H&E显示类器官具腔样结构；PAS染色证实黏液分泌；TEM可见顶端微绒毛、桥粒（desmosome）及分泌囊泡；IF显示强表达KRT-18、TROP2、EpCAM，不表达腺上皮标记FOXA2，并检出纤毛细胞标记FOXJ1及干性转录因子SOX9；撤除EphrinA1-Fc后SOX9、LGR5、CD44等干性基因显著下调，表明EphrinA1/EphA信号调控LE类器官干性。
顶膜朝外（apical-out）极性类器官的建立与表征
将Matrigel包埋类器官释放后于超低吸附板悬浮培养，48 h内76%发生部分极性反转，86%完全转为ZO-1定位于外侧的apical-out构型；apical-out类器官直径较basal-out小，Ki-67阳性率降低，提示极性状态与增殖活性相关。
Apical-out与Basal-out类器官的激素响应
经E2、E2+MPA、E2+MPA+IFN-τ处理，两类极性类器官基因表达模式一致：E2上调PGR（progesterone receptor）；E2及E2+MPA协同上调SPP1（secreted phosphoprotein 1 / osteopontin）与MUC1；TGFB1（transforming growth factor beta 1）呈E2诱导—MPA抑制—IFN-τ挽救三相调控；MMP-2（matrix metallopeptidase 2）在E2+MPA下峰值表达并被IFN-τ部分抑制；增殖基因PCNA、CCND1、CDK4受E2诱导、MPA抑制；Western blot结果与mRNA趋势吻合，证明apical-out类器官保留完整激素响应。
转录组水平对原位腔上皮的模拟度
与scRNA-seq定义的原位LE伪 bulk及基质细胞比对的层次聚类显示类器官与LE聚为一类；共有752个相对于基质细胞共上调基因富集于细胞黏附、上皮发育及分泌过程（GO分析）；上皮标志CDH1、KRT18、EpCAM，分泌标志MUC1及绵羊LE特异标志WFDC2、IGFBP2在类器官与原位LE中均高表达；E2/E2+MPA/E2+MPA+IFN-τ处理可分别激活雌激素、孕激素及IFN-刺激基因（ISGs），证实生理相关激素响应。
多维功能验证：囊胚支持、滋养层增殖及底物特异性黏附
非接触共培养使孵化第8天囊胚直径显著增加（～20.25%），提示类器官分泌促胚胎发育因子；Transwell中间接共培养使滋养层细胞S期比例呈上升趋势；类器官最快黏附于滋养层单层（＜6 h），次为子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cells, ESCs）单层、纤连蛋白包被板及普通培养板；E2+MPA及E2+MPA+IFN-τ预处理显著增强4 h黏附率及解离后单细胞在纤连蛋白上的黏附（CCK-8检测），模拟了激素致敏下LE–滋养层互作增强现象。
四、讨论与结论总结
讨论指出：(1) 绵羊LE类器官依赖WNT/β-catenin激活（CHIR99021协同WNT3A）、Y-27632＋SB202190维持干细胞性与活力、EphrinA1-EphA信号促进增殖，此组合为反刍动物LE类器官建立之关键；(2) 类器官具极化、黏液分泌及微绒毛等超微结构，但缺基膜与基质细胞互作，长期成熟受限，未来可引入共培养或生物反应器；(3) apical-out极性反转约48 h完成，较肠类器官快，伴随可逆性增殖抑制；(4) 激素响应谱与原位LE一致，且揭示绵羊LE潜在雌激素–SPP1通路，为体内被孕激素主导信号掩盖之LE特异调控；(5) 类器官促囊胚扩展及激素增强黏附反映其功能保真度，但尚不能模拟体内合胞体融合等复杂植入事件。
结论（翻译自Conclusions部分）：
本研究成功建立功能性绵羊子宫内膜腔上皮类器官，并系统验证其在形态、分子及功能上与原位组织相似。该模型忠实重现典型腔上皮特征——包括极化结构、黏液分泌及特异性分子标志物表达——同时准确模拟激素响应及胚胎互作等关键生理过程。转录组分析证实类器官与原位腔上皮高度相似；功能实验进一步证明类器官可支持胚胎发育并促进滋养层增殖。此外，本研究揭示了EphA信号在调控类器官干性属性中的新作用。该模型为研究反刍动物胚胎植入机制提供了可靠平台，为提高家畜繁殖效率新策略的开发奠定基础，并为生殖障碍研究提供新技术途径。
