革兰氏阴性克雷伯氏菌*Klebsiella michiganensis* M5al定向进化以提高干燥耐受性和喷雾干燥封装过程的存活率

《Systems Microbiology and Biomanufacturing》：Directed evolution of Gram-negative Klebsiella michiganensis M5al for desiccation tolerance and survivability of a spray-drying encapsulation process

　　

喷雾干燥是一种可规模化的干微生物接种剂生产方法，但革兰氏阴性菌在干燥胁迫下常表现出较低的存活率。研究人员采用定向进化方法，提高固氮菌*Klebsiella michiganensis* M5al在交叉海藻酸钙微胶囊（CLAMs）喷雾干燥封装过程中的存活率。野生型*K. michiganensis* M5al在逐步增加的选择压力下，连续传代通过CLAMs喷雾干燥过程。粉末中活菌密度较基线提高超过1000倍，在定向进化实验过程中达到3.07 × 10¹⁰ CFU/g。配对试验证实，进化分离株相对于亲本菌株的存活率有统计学显著增加（平均差异1.39 log₁₀，P?**论文解读：定向进化提升革兰氏阴性菌喷雾干燥存活率的研究**

**研究背景与问题**

微生物接种剂，尤其是携带固氮、促生等功能的革兰氏阴性菌，在农业领域具有重要应用价值。然而，将活菌以低成本、高效的方式递送至植物，尤其是制备成便于储存和运输的干粉剂型，仍面临巨大挑战。喷雾干燥因其操作成本低、可规模化而成为生产干粉接种剂的首选方法，但该过程中快速脱水和高温对革兰氏阴性菌造成严重损伤，导致细胞大量死亡，产品有效性降低。虽然已有研究通过优化配方（如添加保护剂）或预处理培养来提高存活率，但这些方法往往需要针对不同菌株进行大量调试，且效果有限。目前，尚缺乏一种通用策略来预测或提升微生物对特定干燥过程的耐受性。因此，需要探索新的途径，从微生物自身遗传适应性入手，在不依赖配方调整的前提下增强其抗干燥能力。

**研究目的与意义**

本研究旨在通过定向进化方法，在不改变标准封装配方的情况下，显著提升模式革兰氏阴性固氮菌*Klebsiella michiganensis* M5al对喷雾干燥封装过程的耐受性。研究人员设想，通过反复筛选喷雾干燥后的幸存者并进行传代培养，可促使菌群积累有益突变，从而快速演化出更强的干燥耐受表型。该研究不仅为改善微生物接种剂的可制造性提供了一种实用框架，还揭示了中心碳代谢在干燥胁迫适应中的潜在作用，为后续开发更广泛的工业干燥耐受策略奠定基础。论文发表在《Systems Microbiology and Biomanufacturing》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用了以下关键技术方法：（1）**定向进化策略**：将庆大霉素抗性标记的*K. michiganensis* M5al-Tn7Gm作为起始菌株，反复通过交叉海藻酸钙微胶囊（CLAMs）喷雾干燥封装-释放-再培养循环，逐步提高选择压力（通过调节喷雾干燥进出口温度与进料速率）；（2）**喷雾干燥封装系统（CLAMs）**：利用pH介导的交联系统，将菌体封装于海藻酸钙微胶囊中；（3）**活菌计数与统计分析**：通过稀释涂布法测定菌落形成单位（CFU/g），并基于固体含量标准化计算存活率损失（dlog₁₀），采用配对t检验比较亲本与进化菌株的存活差异；（4）**全基因组测序与突变分析**：利用Illumina短读长测序对保存的群体样本进行测序，并通过breseq分析流程在多态性模式下识别单核苷酸突变及其频率。样本来源为研究人员自行标记的实验室菌株。

**研究结果**

**首次喷雾干燥：未配方与配方的菌液对比**
研究人员将野生型*K. michiganensis* M5al分别以未配方全菌液和CLAMs配方形式进行喷雾干燥，发现在低出口温度（~45°C）条件下，未配方菌液产生了粘稠糖浆而非粉末，而配方菌液存活率约损失3 log₁₀ CFU/g，但粉末质量较差。为排除污染干扰，后续使用了庆大霉素抗性标记菌株M5al-Tn7Gm。

***K. michiganensis* M5al-Tn7Gm在CLAMs中的基线存活率**
在标准CLAMs配方和低出口温度（40°C左右）条件下，亲本菌株存活损失高达5 log₁₀，粉末中活菌仅约1.5×10⁵ CFU/g，确立了进化的基线水平。

**定向进化显著提高CLAMs中克雷伯氏菌的存活率**
经过前5次传代，粉末中活菌从3×10⁵ CFU/g增至8×10⁷ CFU/g，存活损失从5.62 log₁₀降至3.39 log₁₀。第6次传代时，经PCR确认的克雷伯氏菌分离株混合群体表现出更低损失（2.91 log₁₀），活菌达5.37×10⁸ CFU/g。

**增加选择压力对存活率的影响**
在后续第7至第16次传代中，通过提高出口温度（最高达80°C）增加选择压力，存活损失稳定在1.47至2.46 log₁₀之间。第11次传代时，在出口温度50°C条件下，粉末活菌密度达到最高3.07×10¹⁰ CFU/g，仅损失1.47 log₁₀。

**进化分离株持续表现优于亲本菌株**
配对喷雾干燥试验表明，进化分离株的平均存活损失比亲本低1.389 log₁₀（P<0.05，95%置信区间0.778~2.000 log₁₀），且重复性更好。

**DNA测序与breseq分析揭示候选突变**
对进化终末群体（t5）进行全基因组测序并过滤亲本背景突变后，共鉴定55个新突变。其中频率最高的编码序列突变包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因（*pepC*）的单核苷酸缺失（100%频率），该缺失导致提前终止密码子，使PepC蛋白被截短一半。

**磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因被确定为干燥耐受性候选遗传因子**
PepC催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）不可逆羧化为草酰乙酸，是连接糖酵解与三羧酸循环的关键回补反应。蛋白结构预测显示，C端调控结构域缺失会破坏四聚体形成，可能消除酶活性，导致PEP积累。这种代谢通量改变可能通过减慢中心碳代谢或影响相容溶质运输，增强干燥胁迫下的存活能力。

**讨论与结论**

本研究证明，通过定向进化可快速、显著提升革兰氏阴性菌在工业喷雾干燥条件下的存活率，且无需改变配方。进化分离株的存活损失较亲本降低超过3个数量级，粉末活菌载量在优化条件下超过10¹⁰ CFU/g。突变分析指向*pepC*基因，暗示中心碳代谢与干燥耐受性相关，但具体机制仍需进一步代谢研究阐明。该工作为筛选和遗传表征具有增强工业干燥耐受性的微生物提供了实用框架。未来需结合靶向代谢分析、调控研究和配方调控，将这一发现转化为微生物生物刺激剂生产的通用设计规则。

**结论部分翻译：**
本研究表明，在工业相关喷雾干燥条件下进行定向进化，可以在不改变配方的情况下快速且显著地提高革兰氏阴性菌的干燥耐受性。通过迭代筛选CLAMs喷雾干燥封装的幸存者，*Klebsiella michiganensis* M5al的存活率较亲本菌株提高了超过三个数量级，在优化条件下活菌载量超过10¹⁰ CFU/g。重要的是，这些增益是在使用固定标准CLAMs配方下实现的，证明仅靠遗传适应即可有效增强微生物的可制造性。总体而言，这项工作建立了一个实用框架，用于筛选和遗传表征具有增强工业干燥胁迫耐受性的微生物。未来整合靶向代谢分析、调控分析和基于配方的鉴定途径调控研究，对于将这些见解转化为微生物生物刺激剂和接种剂制造的广泛适用设计规则至关重要。

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