基于HepaRG细胞系模型对微囊藻毒素-LR、-LA和-RR的肝毒性及潜在致癌性的机制研究

《Archives of Toxicology》：Mechanistic investigation of the hepatotoxicity and potential carcinogenicity of microcystin-LR, -LA, and -RR in the HepaRG cell line model

　　

微囊藻毒素（MCs）是存在于水体和食物中的蓝藻毒素，被怀疑对健康构成重大风险，特别是对肝脏。为深入了解MCs肝毒性机制及其潜在致癌性，本研究在HepaRG细胞中研究了MC-LR、-LA和-RR（在细胞摄取和解毒效率方面存在差异的同类物）对蛋白磷酸酶2A（PP2A）活性、细胞增殖以及聚焦毒性通路和致癌性的基因表达谱的影响。三种MCs对PP2A活性的抑制程度相似；然而，仅MC-LR和-LA显著增加细胞增殖。基因表达谱（mRNA）分析显示，MC-LR和-LA诱导了强烈且相似的处理效应（R²=0.66），而-RR影响的基因较少，与其他两种同类物的相关性较弱（-LR与-RR的R²=0.31；-LA与-RR的R²=0.06）。此外，仅MC-LR和-LA（非-RR）影响多种肝脏富集毒性通路，这些通路与肝细胞癌/肝癌、胆汁淤积和纤维化密切相关。所有同类物均改变致癌相关miRNA的表达，但其间未观察到一致的模式。总体而言，现有发现强化了MCs的同类物特异性毒性，这很可能由同类物间毒代动力学的差异驱动。此外，研究结果提示MC诱导的肝脏效应还涉及PP2A非依赖性机制，因为尽管MC-LR/-LA和-RR的PP2A抑制水平相当，但两者引发了显著不同的生物学应答。最后，该研究证明了基于新途径方法学（NAM）的方法在评估MC家族肝脏效应（肝细胞）方面的适用性，并且由于研究了结构不同的同类物，所提供的数据可用于交叉参照和分组。

**一、研究背景与问题提出**

微囊藻毒素（MCs）是由多种蓝藻产生的结构相关性环状寡肽毒素家族，广泛分布于水环境中，在藻华期间其出现频率显著增加。饮用水是MCs最可能的暴露途径，世界卫生组织（WHO）设定的安全限值为1 μg/L，但由于MC危害特性数据存在空白，该值为临时性指导值。除水之外，MCs在鱼类、贝类等食物中的存在也可能对人类健康构成风险，慢性暴露的可耐受日摄入量（TDI）暂定为0.04 μg/kg体重，该值同样基于高度不确定性且主要来源于MC-LR的数据。MCs的通用结构式为环-(D-Ala¹-X²-D-MeAsp³-Z⁴-Adda⁵-D-Glu⁶-Mdh^a7)，其中X和Z为可变氨基酸，已鉴定出310种同类物。MC-LR被国际癌症研究机构（IARC）列为可能对人类致癌（2B组），基于其体内促肿瘤活性。MCs的健康效应主要与肝功能障碍相关，因其细胞摄取由在肝细胞中高表达的有机阴离子转运多肽（OATP）介导。目前最被接受的MC肝毒性机制涉及蛋白磷酸酶2A（PP2A）的抑制，导致下游蛋白过度磷酸化。然而，包括MC-LR在内的MCs在肝脏中广泛毒性效应的力学基础仍不清楚。近年研究表明，MCs可能还有其他调节蛋白作为分子靶点，表观遗传效应（如非编码RNA失调）也完全未被充分探索。由于高纯度MCs的有限可用性限制了体内数据生成，人源体外模型被提出用于获取同类物特异性毒性知识并推进MC风险评估。HepaRG细胞系是一种双能人源祖细胞系，可分化为肝细胞样和胆管细胞样细胞，保留了与成熟人肝细胞相似的特征，包括主要P450酶的表达，且与其他细胞系相比具有适当的OATP表达水平，这使其成为研究MC毒性的理想模型。

**二、关键技术方法**

研究采用HepaRG细胞系（来源于Biopredic International），经14天增殖培养、14天分化培养（含1.7% DMSO）获得完全分化细胞。三种MC同类物（MC-LR、-LA、-RR，纯度>95%，购自Enzo Lifescience）设0.04–5 μM的浓度梯度进行24小时暴露。主要技术手段包括：（1）WST-1和中性红（NR）染色法评估细胞毒性；（2）基于碘化丙啶（PI）染色的流式细胞术进行细胞周期分析；（3）孔雀石绿磷酸盐比色法测定PP2A活性；（4）采用Qiagen RT² Profiler PCR Array进行通路聚焦的基因表达谱分析（mRNA：Human Molecular Toxicology PathwayFinder 384HT；miRNA：Human Cancer PathwayFinder X-Large Focus），在ABI 7900HT Fast Real-Time PCR系统上进行定量反转录聚合酶链式反应（RT-qPCR），并通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行通路富集分析；（5）利用R语言进行主成分分析（PCA）、相关性分析及ceRNA网络预测。

**三、研究结果**

**细胞毒性、细胞增殖与PP2A活性**：三种MCs均呈浓度依赖性细胞毒性。MC-LR和-LA在WST-1检测中表现出更强的细胞毒性效应。在细胞增殖方面，MC-LR和-LA在1.1 μM时显著增加S+G₂/M期细胞比例并降低G₁/0期细胞比例，提示其具有促增殖效应。PP2A活性检测显示，三种MCs均在最高测试浓度（1.1和2.5 μM）显著抑制PP2A活性，MC-LR在0.3 μM即出现抑制。在2.5 μM时，MC-LR、-LA和-RR的抑制倍数分别为0.76、0.71和0.66。

**差异表达基因（DEGs）**：PCA揭示MC-LR和-LA对蛋白编码基因表达产生强烈且相似的处理效应，而-RR的处理效应更接近阴性对照。MC-LR与-LA的线性回归分析显示强相关性（R²=0.66），-RR与两者的相关性较弱（与MC-LR：R²=0.31；与MC-LA：R²=0.06）。MC-LR和-LA引起更多与肝毒性和致癌性相关基因的扰动，且表达模式以下调为主，调控幅度更为显著且相互接近。对于miRNA，三种MCs虽均调节致癌相关miRNA的表达，但特异性miRNA的一致性极低，仅miR-219a-5p为共同下调的miRNA。

**通路富集分析**：MC-LR和-LA诱导的DEGs在外源性物质代谢、核受体信号、线粒体/代谢功能障碍以及氧化应激/细胞防御等通路中高度富集。DEG特征和富集的肝脏毒性通路与肝功能障碍相关，主要为胆汁淤积、纤维化和肝细胞癌/肝癌。MC-RR虽在肝脏毒性通路中也达到统计学显著性，但有限的基因重叠（每组毒性通路或疾病/功能注释仅1–2个DEG）降低了其与肝脏损伤和疾病关联的可靠性。

**疾病/功能注释关系与毒性通路的关联**：MC-LR和-LA被预测诱导相似的毒性通路，其基础DEG与肝细胞癌/肝癌、胆汁淤积和纤维化等多种肝脏病理相关。MC-RR虽也显示受影响毒性通路与肝细胞癌/肝癌和胆汁淤积的关联，但仅基于两个DEG（CYP7A1、CYP2E1），表明其效应远弱于-LR和-LA。

**潜在miRNA-mRNA靶点相互作用**：基于实验验证的miRNA-mRNA相互作用构建的竞争性内源RNA（ceRNA）网络未鉴定出差异表达miRNA与差异表达mRNA之间的统计学显著负相关，可能源于ceRNA网络预测标准的严格性（仅使用实验验证的相互作用）以及差异表达mRNA搜索范围的限制（384个基因的 panel）。

**四、讨论与结论**

研究结果明确显示，除PP2A活性抑制程度相似外，各标志物对三种MCs的应答存在差异，证明同类物间存在毒性反应差异。MC-LR和-LA在蛋白编码基因表达水平变化和增殖效应方面呈现出非常相似的模式，而-RR的效应显著不同。

关于核受体信号通路，CAR/RXR、FXR/RXR、PXR/RXR、PPARα/RXRα和芳烃受体（AhR）通路在MC处理后富集，但大多数经典通路内的基因呈下调趋势，表明通路抑制而非化学物暴露时通常预期的激活。这为细胞色素P450（CYP）酶的观察性下调提供了力学基础，因为这些核受体是I-II相外源性物质代谢的关键转录调节因子。与海洋毒素冈田酸（OA，PP2A强效抑制剂）的比较显示，虽在CAR通路相关调控机制上存在相似性，但NF-κB介导的炎症机制并不一致，IL6和TNF等关键细胞因子的表达在幅度和方向上呈可变模式，提示存在PP2A非依赖性调控机制。

氧化应激方面，MC-LR和-LA强烈下调抗氧化防御基因CAT和GPX2，转录应答可能反映氧化应激状态。GPX4在MC-LR和-LA中显著下调，而GPX4活性降低是铁死亡（ferroptosis）的典型标志，这种氧化性细胞死亡以广泛脂质过氧化为特征。

在肝细胞癌发生方面，多种肝肿瘤抑制基因及不良预后标志物（NR1H4、SLC10A1、CYP2C9、CYP1A2）在MC-LR和-LA暴露后显著下调，而MKI67和RAD51等增殖标志物上调，与观察到的细胞增殖增加一致。miR-219-5p为三种MC共同下调的miRNA，该miRNA低表达与肝细胞癌（HCC）较大肿瘤体积和较短总生存期相关。

胆汁淤积方面，所有MCs均观察到与该肝损伤相关的转录应答，但MC-LR和-LA的概率最高。最可能的机制是肝胆汁转运体抑制（如NTCP，由SLC10A1编码）和氧化应激，最终导致胆汁淤积。几种半胱天冬酶（包括主要执行分子caspases 3和7）的下调提示细胞死亡可能主要通过凋亡以外的替代机制发生。

研究结论指出，测试的MC同类物可诱导肝毒性并表现出潜在促肿瘤效应，但这些效应的幅度因同类物而异，强化了MC家族内同类物特异性毒性的概念。此外，现有发现提示PP2A非依赖性机制而非单独的PP2A抑制，解释了毒性的大部分同类物特异性差异。识别MC诱导效应的调控主因需要对关键同类物的基因表达变化进行全面表征，即转录组学数据。本研究采用的体外方法通过捕捉体内相关的不良反应，推进了对MC家族毒性机制的理解，尤其对数据最丰富的MC-LR具有价值。因此，该体外方法在MC同类物毒性研究中显示出潜力，并支持该天然毒素群风险评估的进展。