前额叶皮层中Neurocan的耗竭损害时序识别、认知灵活性及胞周GABA能神经支配

《Cellular and Molecular Neurobiology》：Depletion of Neurocan in the Prefrontal Cortex Impairs Temporal Order Recognition, Cognitive Flexibility and Perisomatic GABAergic Innervation

　　

神经细胞外基质（ECM）的浓缩形式称为周围神经元网络（PNNs），主要与皮层和海马中表达parvalbumin（PV⁺）的中间神经元相关。PNNs富含lecticans，包括神经蛋白聚糖（Ncan）。人类Ncan基因的遗传变异与海马依赖性记忆的改变、前额叶皮层（PFC）结构差异以及精神分裂症和双相情感障碍风险增加有关。然而，Ncan对PFC依赖性认知功能和突触组织的具体贡献尚不完全清楚。在此，研究人员研究了小鼠边缘下皮层（被认为是人内侧PFC背内侧部分的同源区域）中Ncan区域特异性减少的后果。通过使用靶向Ncan的shRNA进行皮层内腺相关病毒递送，研究人员检测了PNN相关标记物、突触组织和PFC依赖性行为。Ncan敲低与PV⁺中间神经元周围PNNs的Wisteria floribunda凝集素（WFA）标记减少相关，表明PNN组成发生改变。在行为学上，Ncan表达降低的小鼠在内侧PFC依赖性时序识别记忆和迷宫任务中的逆转空间学习方面表现出轻微但一致的损害。在细胞水平，免疫组织化学分析显示与PV⁺中间神经元胞周GABA能神经支配相关的标记物减少，同时周围神经纤维网中vGLUT1免疫阳性点的密度增加。这些结构变化在组成性Ncan敲除小鼠中未观察到，表明该模型中存在代偿机制。总之，研究人员的发现强调了Ncan在支持胞周GABA能神经支配、时序识别记忆和认知灵活性中的功能作用，这些是神经精神疾病中受损的重要认知资源。

内侧前额叶皮层（mPFC）对长期记忆存储、决策和认知灵活性至关重要。神经细胞外基质（ECM）的浓缩形式——周围神经元网络（PNNs）紧密围绕在表达parvalbumin（PV⁺）的中间神经元周围，参与突触可塑性和记忆过程。PNNs富含lecticans，包括神经蛋白聚糖（Ncan）。人类Ncan基因多态性（SNP rs1064395）与海马依赖性记忆改变、前额叶皮层（PFC）结构差异以及精神分裂症和双相情感障碍风险增加相关。然而，Ncan对PFC依赖性认知功能和突触组织的具体贡献尚不完全清楚。此前研究采用Ncan敲除（KO）小鼠或酶消化ECM的方法存在代偿机制激活或非特异性作用的局限性。因此，研究人员采用shRNA介导的敲低方法，在成年小鼠边缘下皮层（与人类内侧PFC背内侧部分同源）区域特异性降低Ncan表达，系统探究其对PNN维持、认知行为和突触组织的影响。该研究发表在《Cellular and Molecular Neurobiology》。

研究人员开展的研究及主要技术方法：主要关键技术包括：（1）使用AAV2/DJ病毒载体递送靶向Ncan的shRNA进行体内敲低；（2）行为学测试：旷场实验评估一般活动和焦虑水平；时序识别（recency）任务评估mPFC依赖性时序识别记忆；干迷宫（labyrinth）任务评估空间学习、逆转学习及记忆巩固和检索；（3）免疫组织化学染色结合共聚焦显微镜定量分析PNN标记（WFA、Ncan）、抑制性突触标记（vGAT、PV⁺）和兴奋性突触标记（vGLUT1、vGLUT2、PSD95）的荧光强度和点密度；（4）样本队列：共30只雄性小鼠，包括10只Control shRNA注射的C57BL6/J小鼠、10只Ncan shRNA注射的C57BL6/J小鼠、5只野生型和6只Ncan KO小鼠（来自Zhou等2001的相同创始群体）。

研究结果：

Knockdown of Ncan Expression Impaired PNN Maintenance：通过免疫组化分析，与Control shRNA组相比，Ncan shRNA注射小鼠在GFP⁺细胞的PNNs中Ncan蛋白荧光强度显著降低（约25%），同时WFA荧光强度也显著降低（图1C）。相关性分析显示，在Ncan shRNA组中Ncan与WFA强度呈显著正相关（Spearman rho=0.559，p<0.0001），而Control组无相关。在Ncan KO小鼠中，WFA荧光强度反而显著增加（图1F），提示组成性缺失诱发代偿性PNN糖基化改变。

Impaired Temporal Order Recognition and Worsened Reversal Spatial Learning After Ncan Knockdown：旷场实验显示两组小鼠在运动距离和中心/外周时间比上无差异，排除焦虑和运动能力影响。在时序识别任务中，AAV注射后8周两组均未表现出对新旧物体的偏好差异；但16周后，Control shRNA小鼠对旧物体的探索时间显著多于新物体，而Ncan shRNA小鼠无此差异，且辨别比率分析显示出显著的组间交互效应（shRNA × Time：p=0.0086），表明Ncan敲低损害了mPFC依赖性时序识别记忆。在迷宫任务中，学习和逆转学习阶段两组的平均距离和错误数总体无差异，但在第1次逆转学习阶段第2次训练时，Ncan shRNA小鼠的距离更长、错误数更多（p分别为0.0406和0.0286）。检索指数分析显示Ncan shRNA小鼠在逆转学习后隔天的记忆巩固有减弱趋势（第2次逆转学习阶段p=0.0662）。决策准确性指数显示Ncan shRNA小鼠在逆转学习后隔天对阻塞路径的进入错误更多（第1次逆转学习阶段p=0.0294，第2次逆转学习阶段p=0.0699），表明Ncan对逆转空间记忆的巩固和准确检索至关重要。

Reduced GABAergic Innervation After Ncan Knockdown：免疫组化分析显示，Ncan shRNA小鼠PV⁺中间神经元胞周vGAT⁺和PV⁺突触点的荧光强度显著降低，PV⁺点密度也减少（图4B,C）。在CAMKII⁺锥体神经元上，vGAT⁺点无变化，但PV⁺点强度和密度降低（图4E,F）。CAMKII本身荧光强度无变化。

Increased Glutamatergic Innervation After Ncan Knockdown：在神经纤维网中，vGAT⁺点无差异，但PV⁺点强度和密度降低（图5C）。PSD95⁺点无变化。vGLUT1⁺点的荧光强度和密度显著增加（图5F），而vGLUT2⁺点无变化（图5H）。表明Ncan敲低导致皮层源性兴奋性输入增加。

Effect of Ncan Knockout on Inhibitory and Excitatory Innervation：在组成性Ncan KO小鼠中，PV⁺中间神经元或CAMKII⁺锥体神经元周围vGAT、PV点以及神经纤维网中vGLUT1和PSD95均无显著变化（图6B,D,E,H,I），支持成年后敲低与发育期完全缺失导致不同结果，提示代偿机制的存在。

讨论总结：讨论部分指出Ncan对PNN维护的贡献与之前MNTB研究一致，但区域差异和敲低程度（约25% vs 100%）可能导致不同结果。行为学结果与人类风险等位基因携带者的认知缺陷一致，提示Ncan通过影响ECM完整性调节记忆巩固和认知灵活性。突触变化（GABA能输入减少、vGLUT1⁺输入增加）可能改变mPFC的兴奋/抑制（E/I）平衡，进而影响认知功能。局限性包括免疫组织化学标记仅反映突触组织结构而非功能，未建立直接因果联系。结论部分：总体而言，研究人员的研究结果支持mPFC中ECM组成有助于突触组织，并可能影响诸如时序记忆和认知灵活性等认知过程。