CLDN5 DNA甲基化（DNAm）与创伤后应激障碍（PTSD）的纵向研究

《Journal of Behavioral Medicine》：A longitudinal study of CLDN5 DNA methylation and PTSD

　　

创伤后应激障碍（PTSD）与晚年认知功能减退及神经退行性变风险升高相关，但其潜在生物学机制仍不清楚。一个被假设的途径是通过闭锁蛋白-5（Claudin-5，CLDN5）表达改变导致血脑屏障（BBB）功能障碍，CLDN5是维持BBB完整性的关键紧密连接蛋白。研究人员既往的横断面研究发现，血液中CLDN5基因的三个位点DNA甲基化（DNAm）与创伤暴露、PTSD症状严重度及血浆神经丝轻链（NFL）相关。在此基础上，本研究检验了血液中CLDN5 DNAm是否能预测未来的PTSD症状严重度、NFL、神经心理测验成绩以及血液中CLDN5 RNA表达（作为脑内CLDN5的可能代理指标）。创伤暴露的退伍军人（N=221；174人完成随访）在平均5.6年间接受两次评估。受试者完成诊断访谈，在两个时间点提供血样，并在随访时完成神经心理测验电池（California言语学习测验第2版、Wechsler成人智力量表及Delis-Kaplan执行功能系统子测验）。基线时CLDN5 DNAm在cg21872764位点可预测随访时PTSD症状严重度升高，且在校正基线PTSD症状后成立（β=.128，p=.035）。该探针与未来CLDN5 RNA表达相关（β=-.186，p-adj=.035），cg00804504亦然（β=.185，p-adj=.035）。与认知减退相关的cg16773741位点CLDN5 DNAm可预测随访时工作记忆成绩（β=.269，p-adj=.015）。经多重检验校正后，无任何位点与NFL水平相关。结果表明，在具有大量创伤史的退伍军人中，CLDN5 DNAm与随时间推移PTSD严重度增加及神经心理功能相关。这提示BBB破坏可能是PTSD病理的一部分，有助于明确PTSD与神经退行性疾病共病的生物学基础。

论文发表于《Journal of Behavioral Medicine》。该研究围绕创伤后应激障碍（PTSD）与神经退行性疾病共病的生物学机制展开。目前已知PTSD与晚年认知减退、阿尔茨海默病等神经退行性疾病风险升高相关，但其中的生物学通路并不清楚。一个新兴假说是血脑屏障（BBB）功能障碍发挥了作用，而闭锁蛋白-5（Claudin-5，CLDN5）是维持BBB紧密连接完整性的关键蛋白。研究人员此前在横断面的退伍军人血样及死后背内侧前额叶皮层组织中，发现CLDN5的三个DNA甲基化（DNAm）位点（cg00804504、cg17411190、cg21872764）与创伤暴露、PTSD严重度相关，且cg21872764与血浆神经丝轻链（NFL，轴索损伤标志物）相关。但由于横断面设计无法确定时序关系，也难以推断BBB相关表观遗传改变是否先于症状演变，因此研究人员开展了这项纵向研究，旨在明确外周血CLDN5 DNAm能否前瞻性预测PTSD症状严重度、NFL水平、神经认知功能及CLDN5 RNA表达，并检验另外两个曾与认知轨迹相关的CLDN5 CpG位点（cg05460329、cg16773741）是否与后续神经心理表现有关，从而判断BBB表观遗传标志物是否可作为PTSD神经病理与共病的预警指标。

研究人员主要采用以下关键技术方法：样本来自创伤暴露的美国退伍军人队列（基线N=221，平均约5.6年后随访n=174，多为男性、白人、中老年），所有受试者完成临床诊断性访谈（CAPS for DSM-IV/DSM-5，并统一标准化为0–1分数）与神经心理测验电池（California Verbal Learning Test-II、WAIS-IV Digit Span、D-KEFS子测验，通过验证性因子分析提炼工作记忆、执行/注意功能、言语记忆三个潜变量）；外周血提取DNA采用Illumina Infinium EPIC BeadChip检测CLDN5 DNAm位点，并用EpiDISH包估算白细胞亚型比例、基于34个位点计算DNAm吸烟评分；RNA来自PAXgene管，经Illumina TruSeq Stranded Total RNA建库测序，STAR比对hg38，RSEM定量表达，CIBERSORT反卷积免疫细胞比例；血浆NFL用Simoa Neurology 4-Plex E kit测定；纵向关联分析对PTSD与DNAm采用交叉滞后面板模型（Mplus，协变量含基线PTSD、DNAm、年龄、性别、随访间隔天数、白细胞比例、DNAm吸烟评分、终生创伤暴露数），其余前瞻回归（SPSS）分别检验基线CLDN5 CpG对随访NFL、神经心理潜变量、CLDN5 RNA的预测，并按分析性质决定是否用FDR校正。

研究结果

CLDN5 DNAm与PTSD症状随时间的变化

通过交叉滞后面板模型发现，PTSD严重度在时间上中度稳定，而三个位点的DNAm跨时空相关性较弱。结果显示基线cg21872764的DNAm在控制基线PTSD严重度及其他协变量后，可正向预测随访PTSD严重度升高（β=.128，p=.035）；cg17411190（β=-.013，p=.843）与cg00804504（β=-.051，p=.391）无显著预测效应。反向路径（基线PTSD预测随访DNAm）在任何位点均无显著性。

CLDN5 DNAm与NFL随时间的变化

既往横断面中与NFL相关的cg21872764并不能在多重检验校正后显著预测随访NFL（β=.061，p=.346），NFL本身具中度时间稳定性（β=.522，p<.001）。另两个PTSD相关位点中，cg00804504显示名义正向关联（β=.127，p=.034，p-adj=.102），但未通过FDR阈值；cg17411190也无显著效应。

CLDN5 DNAm与神经心理功能随时间的变化

在测试的五个CpG中，基线cg16773741的DNAm显著正向预测随访工作记忆潜变量得分（β=.269，p=.001，p-adj=.015），即较高甲基化对应较好工作记忆表现；该位点与执行/注意（β=-.126，p=.109）、言语记忆（β=.053，p=.513）无关。另一曾报道与认知下降相关的cg05460329及三个PTSD主要位点（cg21872764、cg00804504、cg17411190）均未显著预测任一神经心理潜变量。

CLDN5 DNAm与RNA表达随时间的变化

基线cg21872764 DNAm负向预测随访血中CLDN5 RNA表达（β=-.186，p=.023，p-adj=.035），而cg00804504正向预测（β=.185，p=.017，p-adj=.035）；其余位点无显著关联。表明这两个CpG位点的甲基化具有远期功能相关性，可影响后续CLDN5转录水平。

讨论部分总结：在平均5.6年的创伤暴露退伍军人纵向队列中，研究人员发现基线cg21872764位点的CLDN5 DNAm可前瞻性预测PTSD症状严重度升高，且cg21872764与cg00804504的DNAm能预测后续血中CLDN5 RNA表达，cg16773741 DNAm正向预测工作记忆表现。但既往横断面中与NFL相关的cg21872764未能在纵向、FDR校正下预测NFL变化。cg21872764的甲基化在血液与脑前额叶、颞叶区域具跨组织相关性，提示其可能反映脑BBB相关表观遗传状态；cg16773741在血中甲基化与较好工作记忆及外部痴呆相关标志物负关联，而在脑组织中以往报道为正关联认知下降，说明同一CpG在血液与脑中方向可能不同但均具表型意义。两个DNAm位点（cg21872764负向、cg00804504正向）对CLDN5 RNA的远期预测表明这些CpG具有功能含义。局限性包括缺乏CLDN5蛋白血标志物、未测基线神经心理与RNA故无法模型化变化量、样本以中老年白人男性退伍军人为主致推广受限、观察性设计不能推断因果、未系统评估神经退行诊断与创伤亚型特异效应等。结论为：CLDN5这种对BBB完整性至关重要的基因的DNAm，可前瞻性关联于PTSD症状恶化、工作记忆表现及CLDN5表达，支持BBB扰动可能参与PTSD病理及PTSD与神经退行共病的假说，外周CLDN5 DNAm位点有望作为相关风险或轨迹的生物标志物。