来自海参 *Psolus phantapus* 的三种硫酸化三萜糖苷——对人类癌细胞系的生物活性

《Marine Drugs》：Three Sulfated Triterpene Glycosides from the Sea Cucumber Psolus phantapus—Biological Activity Against Human Cancer Cell Lines

　　

首次研究了 *Psolus phantapus* 的糖苷组成。研究人员分离出两种新糖苷，phantapusoside A (1) 和 B (2)，以及已知的 psolusoside P (3)，并通过 ¹H、¹³C NMR、1D TOCSY、2D NMR（¹H、¹H COSY、HMBC、HSQC、ROESY）和 HR-ESI 质谱分析确定了它们的结构。这些化合物在结构上与从 *Psolus* 属其他代表物种（*P. fabricii*、*P. peronii* 和 *P. chitonoides*）中分离的化合物相近。这些数据证实了海参三萜糖苷的化学分类学意义，表明亲缘关系近的物种生物合成结构相似的代谢物。研究人员研究了化合物 1 和 2 对四种人乳腺癌细胞系（MCF-7、T-47D、MDA-MB-231、MDA-MB-468），以及非致癌性乳腺上皮细胞系 MCF-10A 和胰腺上皮样癌细胞系 PANC-1 的细胞毒性活性。这些糖苷对 TNBC 细胞系 MDA-MB-231 和 MDA-MB-468 具有选择性活性。值得注意的是，两种糖苷对 TNBC 细胞系克隆形成能力的抑制作用比对其代谢活性（MTT 法）更显著，并且对基底样细胞系 MDA-MB-468 表现出更明显的集落抑制效应，使该细胞系成为未来研究糖苷抗肿瘤效应的有前景的模型。

## 论文解读：来自海参 *Psolus phantapus* 的硫酸化三萜糖苷的结构与抗肿瘤活性研究

### 研究背景与科学问题

海参（Holothuroidea）因其富含具有生物活性的次生代谢产物——三萜糖苷（triterpene glycosides，也称为皂苷saponins）而受到广泛关注。这些化合物展现出细胞毒性、抗真菌、溶血、免疫调节及抗癌等多种药理活性。海参三萜糖苷的结构特点包括独特的苷元骨架（源于羊毛甾烷lanostane）以及由2至6个单糖组成的寡糖链，其生物学活性和属级特异性与糖链结构密切相关。尤为显著的是，许多海参糖苷含有一个至四个硫酸基团（sulfate groups），它们连接在不同的单糖残基上，影响生物活性和极性。

然而，尽管对海参糖苷已进行大量研究，仍存在若干未解问题，包括参与糖苷生物合成的基因和酶的功能特征，以及生态学方面的问题，例如糖苷组成随物种地理分布和季节变化而产生的变异性。

*Psolus* 属海参是结构多样性的一个突出例子。该属包含58个物种，其中仅有5个物种（*P. fabricii*、*P. eximius*、*P. patagonicus*、*P. chitonoides* 和 *P. peronii*）被进行过化学研究。这些物种产生的糖苷具有高度氧化的苷元、多样的双键位置以及罕见的糖链组成（如四糖链中上、下半链各含两个单元，或上半链三个单元、下半链一个单元），以及独特的硫酸化模式（如葡萄糖单元的C-2和C-4位同时硫酸化，或在一个单糖残基上连接两个硫酸基团）。这些结构特征赋予化合物不同的生物活性，也使其成为化学分类学和药物发现的重要研究对象。

本研究选择 *Psolus* 属中此前未进行过化学研究的 *Psolus phantapus* 作为对象，旨在分离和鉴定其糖苷成分，评估其对人癌细胞系的细胞毒性和克隆形成抑制活性，并探讨构效关系（SAR, structure–activity relationships）。

### 主要技术方法

- **样本来源**：*Psolus phantapus* 标本（5个个体）于2014年8月在俄罗斯阿瓦恰湾（Avacha Bay）通过水肺潜水采集，水深5–15 m，由Stepanov V.G.博士进行分类鉴定，凭证标本保存于俄罗斯太平洋地理研究所堪察加分所。
- **提取与分离**：海参经60%乙醇回流提取，提取物经硅胶柱层析、Polychrom-1疏水层析及反复硅胶柱层析得到总糖苷级分（51.5 mg），随后通过反相高效液相色谱（HPLC）纯化获得三种糖苷（1–3）。
- **结构鉴定**：利用核磁共振波谱（¹H、¹³C NMR、1D TOCSY、2D NMR包括¹H,¹H COSY、HMBC、HSQC、ROESY）和HR-ESI质谱（HR-ESI-MS及MS/MS）解析化合物结构。
- **生物活性测试**：采用MTT法检测糖苷对人乳腺癌细胞系（MCF-7、T-47D、MDA-MB-231、MDA-MB-468）、非致癌性乳腺上皮细胞系MCF-10A及胰腺癌PANC-1的细胞毒性；通过集落形成实验评估对肿瘤细胞克隆形成能力的影响；以已知糖苷cucumarioside A0-1作为阳性对照。

### 研究结果

#### 2.1 糖苷的结构解析

通过综合波谱分析，研究人员鉴定了来自 *P. phantapus* 的三种三萜糖苷：

- **Phantapusoside A (1)**：分子式 C₆₅H₁₀₀O₃₇S₂Na₂。苷元为holosta-7,25-dien-3β-ol-16-one（含18(20)内酯、7(8)双键、25(26)双键和16酮基）。寡糖链为六糖链，由两个木糖（Xyl，作为第一和第三单元）、一个奎诺糖（Qui，第二单元）、两个葡萄糖（Glc，第四和第五单元）和一个3-O-甲基葡萄糖（MeGlc，末端第六单元）组成，通过β-糖苷键连接。两个硫酸基团分别连接在Glc5的C-6和MeGlc6的C-6上。结构确定为3β-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-quinovopyranosyl-(1→2)-[6-O-sodium sulfate-3-O-methyl-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-6-O-sodium sulfate-β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D-xylopyranosyl}-16-keto-holosta-7(8),25-diene。
- **Phantapusoside B (2)**：分子式同上，为化合物1的异构体，苷元相同。寡糖链组成和连接方式也与1一致，但硫酸基团位置不同：一个硫酸基团在Glc5的C-6，另一个在MeGlc6的C-4。其糖链与来自 *P. chitonoides* 的chitonoidoside I相同。
- **Psolusoside P (3)**：已知四硫酸化糖苷，分子式 C₆₀H₉₀O₃₉S₄Na₄，此前从 *P. fabricii* 和 *P. peronii* 中分离得到，其¹³C NMR图谱与文献一致。

这些结果表明，*P. phantapus* 的糖苷在结构上与 *Psolus* 属其他物种的糖苷接近（共享相同苷元、相同糖链或相同的已知化合物），进一步证实了三萜糖苷在属内化学分类学中的意义。

#### 2.2 Phantapusosides A (1) 和 B (2) 的生物活性

- **细胞毒性（MTT法）**：化合物1和2对人红细胞表现出强溶血活性，提示其具有膜溶解作用。对癌细胞系的细胞毒性相对较低，但表现出选择性：对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468（以及胰腺癌PANC-1）的敏感性高于MCF-7和T-47D。这一选择性可能与TNBC细胞高表达腺苷受体A_2B（A_2BAR）有关，海参糖苷作为功能性选择性拮抗剂，通过抑制MAPK通路发挥抗肿瘤作用。然而，1和2对MDA-MB-231的细胞毒性远低于此前筛选的领先糖苷（如阳性对照cucumarioside A0-1），可能是因为其庞大的六糖链限制了膜整合能力。值得注意的是，化合物2的活性高于1，其IC₅₀接近阳性对照；两者仅因硫酸基团位置不同（2在MeGlc6的C-4位，1在C-6位），表明硫酸化位置对细胞毒性有显著影响。同时，1和2的溶血活性几乎相同，提示硫酸化位置差异主要调节受体介导的抗肿瘤机制而非一般膜溶解作用。
- **集落形成抑制**：在非毒性浓度（0.2–2 μM）下，两种糖苷对MDA-MB-231和MDA-MB-468的集落形成表现出剂量依赖性抑制，对MCF-7和PANC-1的抑制较弱。化合物2的效果优于1。例如，0.5 μM时，2对MDA-MB-231和MDA-MB-468的集落抑制分别为47%和84%；1 μM时分别为88%和95%；2 μM时几乎完全抑制两种TNBC细胞的集落形成，并对MCF-7造成54%抑制。化合物1在0.5 μM时抑制率分别为23%和54%，1 μM时为43%和94%，2 μM时同样几乎完全抑制TNBC集落，对MCF-7抑制39%。相比之下，阳性对照cucumarioside A0-1在1–2 μM时对PANC-1和MCF-7均有显著抑制，而1和2对PANC-1无影响。因此，1和2表现出更窄的抗克隆形成活性谱，对TNBC细胞更具选择性。尤其对基底样MDA-MB-468细胞的显著抑制效应使其成为研究糖苷抗肿瘤作用的理想模型。

### 总结与结论

本研究首次报道了海参 *Psolus phantapus* 的糖苷组成，分离并鉴定了两种新糖苷（phantapusosides A和B）及已知的psolusoside P。通过NMR和质谱解析了结构，并评估了它们的细胞毒性和集落形成抑制活性。

讨论部分指出，这些糖苷结构上与 *Psolus* 属其他物种的糖苷相近，进一步支持了三萜糖苷在海参化学分类学中的重要性。细胞活性方面，两种新糖苷对三阴性乳腺癌细胞系（特别是MDA-MB-468）具有选择性抗克隆形成活性，且抑制克隆形成的能力强于抑制代谢活性，提示其通过干扰细胞复制完整性发挥抗肿瘤作用。硫酸基团的位置（C-4 vs C-6）显著影响细胞毒性，但对溶血活性影响不大，表明构效关系主要涉及受体介导的机制。尽管它们的总体细胞毒性低于某些已知的领先糖苷，但因其选择性和对MDA-MB-468的强作用，可作为未来研究糖苷抗肿瘤机制的候选分子。

**研究结论**（翻译）：
本研究从 *Psolus phantapus* 中分离得到的三种三萜糖苷在结构上与 *Psolus* 属其他代表物种（*P. fabricii*、*P. peronii* 和 *P. chitonoides*）的糖苷相近。它们具有与后两种物种糖苷相同的苷元；phantapusoside B (2) 拥有与chitonoidoside I相同的糖链；而 *P. fabricii*、*P. peronii* 和 *P. phantapus* 均含有 psolusoside P (3)。这些数据进一步证明了海参三萜糖苷的化学分类学意义，显示亲缘关系近的物种生物合成结构相似的代谢物。在生物活性方面，phantapusosides A和B对三阴性乳腺癌细胞系（尤其是MDA-MB-468）表现出选择性的抗克隆形成活性，且硫酸基团的位置（C-6 vs C-4）对细胞毒性有显著影响。MDA-MB-468细胞系因其对糖苷的高度敏感性，成为未来研究糖苷抗肿瘤效应的一个有前景的模型。