《International Journal for Parasitology》：A novel hookworm vaccine candidate identified through immunomic profiling of human protective immunity
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摘要：钩虫(Hookworm)感染近5亿人，导致约210万伤残调整寿命年(DALYs)损失。虽然驱虫药可用，但无法防止再感染。疫苗可提供长期免疫力，但目前尚无上市钩worm疫苗。研究人员近期证实，用辐照钩虫幼虫(irradiated hookworm larv
摘要：钩虫(Hookworm)感染近5亿人，导致约210万伤残调整寿命年(DALYs)损失。虽然驱虫药可用，但无法防止再感染。疫苗可提供长期免疫力，但目前尚无上市钩worm疫苗。研究人员近期证实，用辐照钩虫幼虫(irradiated hookworm larvae, irL3)接种可安全诱导人体产生体液和细胞免疫应答，对攻毒感染非辐照寄生虫产生部分保护。研究人员采用免疫组学方法，通过筛选含美洲钩虫(Necator americanus)分泌组(secretome)重组蛋白的蛋白质微阵列，鉴定受种者血清中IgG靶向抗原。对最具免疫反应性的美洲钩虫(N. americanus)蛋白鉴定其直系同源物，并在巴西钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)中重组表达并测试小鼠攻毒模型效力。领衔疫苗候选分子NBR17057——美洲钩虫Na_11335的同源蛋白——提供强效保护，肠道成虫负荷和粪便虫卵计数降低>90%，并伴有抗原特异性IgG水平升高。疫苗接种还刺激腹股沟淋巴结中IgA+B细胞、IgG1+/IgA+浆细胞及IgG1+/IgA+生发中心(germinal centre, GC) B细胞，提示肠道黏膜免疫。脾脏中高水平IgG1+/IgA+B细胞、GC B细胞及浆细胞提示对系统幼虫移行的保护。淋巴结和脾脏中存在IgG1+/IgA+记忆B细胞提示潜在长期抗再感染免疫。结果表明，巴西钩虫(N. brasiliensis)L3幼虫期蛋白NBR17057及其在美洲钩虫(N. americanus)中的同源蛋白Na_11335可作为靶向人钩虫感染期幼虫阶段的亚单位疫苗候选抗原。
本文解读基于发表于《International Journal for Parasitology》的研究论文"A novel hookworm vaccine candidate identified through immunomic profiling of human protective immunity"，由Sarkar E等人完成。
研究背景
钩虫等土源性线虫(Soil-Transmitted Helminths, STHs)感染全球约4.06–4.8亿人，主要由美洲钩虫(Necator americanus)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)及锡兰钩虫(Ancylostoma ceylanicum)引起，成虫寄生于小肠吸血，可致严重贫血、孕妇死亡率增加及儿童发育迟滞，每年造成约90万伤残调整寿命年(DALYs)损失。现行标准治疗为阿苯达唑(albendazole)或甲苯咪唑(mebendazole)，但药物不能预防再感染且苯并咪唑类(benzimidazoles)耐药性日益显现，长期疾病控制困难。人体自然感染钩虫后不产生持久清除性免疫，老年感染者反而虫负荷更高，钩虫病保护性免疫相关性(correlates of protection)尚未阐明。减毒（UV或γ射线辐照）钩虫幼虫(irradiated L3, irL3)在人体临床试验中被证明可安全诱导部分保护性免疫，为从"人源保护性免疫图谱"反向筛选疫苗抗原提供了契机。基于此，研究人员开展免疫组学(immunomic)驱动的抗原来源筛选与临床前验证研究，旨在发现可模拟irL3保护作用的人钩虫亚单位疫苗候选抗原。
主要关键技术方法概述
研究人员收集经美洲钩虫(Necator americanus) irL3疫苗接种且证实获挑战感染保护的人体受试者血清，利用含成虫期美洲钩虫排泄/分泌(excretory/secretory, ES)重组蛋白的高密度蛋白质微阵列筛选免疫显性(immunodominant) IgG靶标，并经ELISA验证。通过BLASTp比对筛选免疫反应性美洲钩虫蛋白在巴西钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)中的直系同源/同源蛋白，选取6个候选基因于HEK293F细胞或大肠杆菌(Escherichia coli)中重组表达。将成功表达的巴西钩虫重组蛋白配铝胶(alum)+CpG寡脱氧核苷酸佐剂皮下免疫BALB/c小鼠，设两剂（第0、14天）和三剂（第0、14、28天）方案，于第35或40天用500条活巴西钩虫L3攻毒，攻毒后7天剖检取肠计算成虫负荷、取粪便做麦克马斯特(McMaster)法测每克粪便虫卵数(eggs per gram, EPG)；攻毒前采血ELISA检测抗原特异性IgG；取腹股沟淋巴结(inguinal lymph nodes)及脾脏制备单细胞悬液，流式细胞术(flow cytometry)分析B细胞亚群（IgA+B细胞、浆细胞plasma cells、生发中心GC B细胞、记忆B细胞及IgG1+/IgA+亚型）。数据经正态性检验后行单因素方差分析(one-way ANOVA)及Tukey多重比较。
研究结果
3.1. Selection of immunogenic proteins from adult N. americanus ES products（美洲钩虫成虫ES产物中免疫原性蛋白的筛选）
研究人员用含约250种美洲钩虫成虫ES重组蛋白的微阵列筛查irL3疫苗接种者攻毒前后血清IgG，鉴定出14个在疫苗接种者中IgG响应显著高于安慰剂组的免疫原性ES蛋白，其中包含注释为胞苷脱氨酶超家族(cytidine deaminase superfamily)蛋白的Na_11335。独立ELISA验证Na_11335可被irL3免疫者血清IgG识别。结论：从irL3诱导的人体保护性免疫血清中成功筛选出14个免疫显性成虫ES抗原，Na_11335为其中具潜在免疫调节功能且被特异性识别的候选靶标。
3.2. Identification of N. americanus homologs/orthologs of N. brasiliensis proteins that were immunoreactive with irL3 vaccinated subjects（与irL3免疫者血清反应的N. americanus蛋白在N. brasiliensis中同源/直系同源物的鉴定）
因美洲钩虫与巴西钩虫直系同源蛋白氨基酸序列同一性均<90%，研究人员放宽标准，BLASTp鉴定6个在irL3免疫血清中呈反应的N. americanus ES蛋白（Na_11211、Na_04727、Na_00935、Na_11335、Na_10702、Na_05794）分别对应N. brasiliensis同源蛋白Nb_10268、Nb_9575、Nb_77377、Nb_17057(NBR17057)、Nb_19665、Nb_13548，序列同一性60%–88%，提示功能与结构保守。结论：确定6个可用于小鼠模型验证的巴西钩虫同源重组候选抗原，其中Na_11335对应NBR17057。
3.3. Assessment of N. brasiliensis recombinant proteins in mouse model for vaccine efficacy（巴西钩虫重组蛋白在小鼠模型中的疫苗效力评估）
6个候选中仅NBR17057（HEK293F表达）、NBR9575和NBR13548（大肠杆菌表达）获足量重组蛋白。BALB/c小鼠两剂免疫后，NBR17057组血清抗原特异性IgG显著高于PBS对照组及既往感染获得性免疫对照组。攻毒后NBR9575和NBR13548组肠虫负荷和EPG与PBS对照组无差异，而NBR17057组肠成虫回收率降低>90%、粪便EPG降低>90%，效果与经活虫初次感染获得抗性小鼠相当。结论：NBR17057——Na_11335的巴西钩虫同源蛋白——在小鼠模型中展现出强效抗巴西钩虫感染保护效力，其余两候选无显著保护。
3.4. NBR17057 dose optimisation（NBR17057免疫剂量/剂次优化）
比较两剂（第0、14天）与三剂（第0、14、28天）免疫方案，两组均较PBS对照显著降低肠虫负荷和EPG，两方案间成虫负荷无统计学差异，三剂组EPG略低于两剂但未达显著差异。结论：两剂免疫已可提供接近最大保护效果，追加第三剂未显著增强效力。
3.5. NBR17057 induces lymph node and systemic IgG1+/IgA+-producing B cell responses（NBR17057诱导淋巴结及全身IgG1+/IgA+产抗体B细胞应答）
流式细胞术分析显示，NBR17057免疫小鼠引流腹股沟淋巴结中IgA+B细胞、IgG1+和IgA+浆细胞及记忆B细胞数量较PBS对照组显著升高，提示黏膜型2型免疫活化。脾脏中IgG1+/IgA+B细胞、GC B细胞、IgG1+浆细胞及记忆B细胞亦显著增多。结论：NBR17057可同时诱导肠道引流淋巴结黏膜相关IgA/IgG1应答及脾脏系统性IgG1记忆B细胞应答，具备靶向幼虫移行阶段（系统）与成虫定植阶段（肠道）的双重免疫潜力。
讨论与结论总结（翻译研究结论部分）
本研究采用免疫组学策略，基于人irL3疫苗接种诱导的保护性免疫血清IgG谱鉴定美洲钩虫成虫ES免疫显性抗原，并通过比较基因组学与鼠钩虫模型验证候选抗原，建立了衔接人源保护性免疫、蛋白质组水平抗原发现及临床前效力验证的钩虫亚单位疫苗研发管线。自14个irL3血清识别ES抗原中选出6个具巴西钩虫同源蛋白者，成功表达并验证表明其中NBR17057（Na_11335同源蛋白，注释为胞苷脱氨酶cytidine deaminase, CDD超家族）在小鼠模型中诱导>90%肠虫负荷及EPG降低，并激发黏膜IgA+B细胞、系统性IgG1+浆细胞/记忆B细胞及GC B细胞扩增。Na_11335编码的CDD在钩虫摄血与高氧化应激微环境中可能参与局部髓系细胞重编程以维持氧化还原和代谢稳态，疫苗诱导抗体有望中和其活性从而破坏虫体摄食、免疫逃逸和组织适应。尽管受限于N. brasiliensis与人钩虫种间差异且仅3/6候选获重组表达，本研究证明经免疫组学筛选的幼虫期ES同源抗原NBR17057/N a_11335是极具前景的人钩虫(尤其是美洲钩虫)感染期幼虫靶向亚单位疫苗候选分子，为打破钩虫再感染循环、开发提供长期免疫保护的疫苗提供了新依据。未来需在受控人感染模型(controlled human infection model, CHIM)中进一步确证其针对Necator americanus的保护效力及相关免疫学特征。
