综述：小型反刍动物捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性：分子机制与诊断方法

《International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance》：Benzimidazole resistance in Haemonchus contortus in small ruminants: molecular mechanisms and diagnostic approaches

　　

苯并咪唑类药物对小型反刍动物捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）的抗性已成为全球范围内制约产业发展的普遍挑战。苯并咪唑类药物因广谱活性、成本低及给药便捷等优势，仍是最常用的抗寄生虫药物类别之一，但该类化合物的过度及不合理使用导致抗性快速出现并在全球扩散，其中致病性强、遗传多样性高的胃肠道线虫捻转血矛线虫尤为突出。苯并咪唑类抗性的主要分子基础为同工型1 β-微管蛋白（isotype-1 β-tubulin）基因的点突变，最核心的突变位点为密码子167（F167Y）、198（E198A）与200（F200Y），这些突变通过改变β-微管蛋白结构阻碍药物结合，最终降低治疗效果。本综述系统梳理了苯并咪唑类抗性的分子机制，并对现有诊断方法进行概述，涵盖体内试验、体外试验，以及实时荧光定量PCR、数字PCR、焦磷酸测序、深度扩增子测序、等温扩增技术等分子检测方法。尽管不同地区抗性相关多态性的分布存在差异，但全球范围内F200Y突变均占主导地位。最后，综述强调需将分子监测与可持续寄生虫防控策略相结合，以延缓苯并咪唑类抗性进一步扩散，保障现有驱虫药的长期有效性。

1. 1.
   背景
   寄生虫感染严重威胁反刍动物福利与养殖系统的经济可行性，其中胃肠道线虫是反刍 livestock 生产中的主要病原，可造成显著的生产损失。该类线虫多属于圆线目、毛圆科，常见属包括捻转血矛线虫（Haemonchus）、古柏线虫（Cooperia）、奥斯特线虫（Ostertagia）、环纹线虫（Teladorsagia）、仰口线虫（Bunostomum）、毛圆线虫（Trichostrongylus）、食道口线虫（Oesophagostomum）、夏伯特线虫（Chabertia）、细颈线虫（Nematodirus）、原圆线虫（Protostrongylus）及鞭虫（Trichuris），主要寄生于皱胃、小肠，偶见于大肠。胃肠道线虫通常抑制宿主食欲与采食行为，降低营养吸收效率，引发贫血、腹泻、虚弱、肉奶毛产量下降、进行性体重减轻、消瘦甚至死亡。在小型反刍动物中，最具经济与福利危害的胃肠道线虫为捻转血矛线虫、环纹线虫属与毛圆线虫属，感染多为混合感染，单一虫种与临床症状的对应关系较难界定。环纹线虫属与毛圆线虫属感染的临床特征相似，主要表现为厌食、腹泻、脱水、下颌水肿、腹部膨大、被毛粗糙干燥、皮肤脱屑及体重下降。捻转血矛线虫是其中流行最广、侵袭性最强的虫种，起源于撒哈拉以南非洲，随牲畜迁徙扩散至全球。该虫自由生活幼虫阶段对寒冷适应性较弱，在温带气候下主要依赖宿主体内寄生阶段越冬。波兰山羊群的研究显示，捻转血矛线虫是检出率最高的虫种，其通过吸食血液及造成皱胃黏膜溃疡性病变产生强致病性，可导致消化功能紊乱与贫血综合征。此外，该虫极易产生驱虫药抗性，进一步增加了防控难度。捻转血矛线虫病的临床特征以贫血为主，可见结膜与黏膜苍白、血浆蛋白丢失导致的下颌水肿（俗称“瓶颌”），非并发症病例中便秘较腹泻更常见，长期感染还可出现体重下降、厌食与无乳等症状。
2. 2.
   抗寄生虫药物使用与胃肠道线虫抗性演化
   自广谱驱虫药问世以来，山羊胃肠道线虫防控长期依赖三类核心药物的高频全群给药：苯并咪唑类（benzimidazoles, BZs，如阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑）、大环内酯类（macrocyclic lactones, MLs，如伊维菌素、多拉菌素、埃普菌素）与咪唑并噻唑类（主要为左旋咪唑，levamisole, LEV）。在未评估寄生虫负荷情况下的常规给药模式，推动了线虫对主要药物类别的抗性演化。抗性定义为同一虫种、同一发育阶段的个体能够耐受常规致死剂量药物的能力，针对捻转血矛线虫等胃肠道线虫，具体表现为药物田间防效较上市初期显著下降。尽管氨基乙腈衍生物莫奈潘特（monepantel）与螺吲哚类化合物德夸太尔（derquantel）等新类别驱虫药已研发上市，但莫奈潘特在上市仅两年后即出现抗性。波兰地区的调查显示，山羊养殖中最常使用的驱虫药为阿苯达唑、芬苯达唑与埃普菌素，这与当地已观测到的苯并咪唑类与大环内酯类抗性现状直接相关。
3. 3.
   胃肠道线虫替代防控方法
   除化学药物治疗外，限制线虫负荷的方法还包括放牧管理、微环境避难所（refugia）策略与生物防控。放牧管理通过牧场轮作、混种放牧与精准调控载畜量，切断线虫生命周期，减少牧场污染。调整放牧模式并设置牧场休牧期，可中断线虫发育循环，降低种群总体密度。微环境避难所是可持续寄生虫管理的核心概念，指未暴露于药物的寄生虫种群部分，包括未治疗宿主或环境中的寄生虫阶段，其可维持种群内的药物敏感基因型，降低抗性选择压。该策略由van Wyk于2001年首次提出，核心是仅治疗群体中的部分个体而非全群给药，保留部分未暴露寄生虫，从而延缓抗性扩散。生物防控定义为“某一物种的活动降低另一物种有害效应的过程”，部分富含单宁或黄酮类化合物的植物已被证实对反刍动物胃肠道线虫具有驱虫活性，可通过干扰线虫生命周期或调节宿主免疫反应发挥作用，将其纳入牧场种植体系或添加至饲粮中，可完善可持续寄生虫管理体系。此外，捕食性真菌、蚯蚓、蜣螂、捕食性线虫与食线虫螨等生物也可作为放牧动物胃肠道线虫的生物防控因子。不过，生物防控剂与高单宁饲料的大规模推广，仍需验证其经济可行性，即需确保抗寄生虫收益高于其在建植、管理及不同生产条件下效果波动带来的成本。
4. 4.
   苯并咪唑类药物：作用机制与胃肠道线虫抗性
   苯并咪唑类药物是应用最广泛的驱虫药类别之一，凭借低成本、广谱活性与给药便捷性受到青睐，代表药物包括芬苯达唑、奥芬达唑、噻苯达唑、奥苯达唑，其中阿苯达唑与甲苯达唑因在人医与兽医领域均有广泛使用而更具代表性。苯并咪唑类药物的作用机制一致：选择性结合线虫β-微管蛋白，抑制α-与β-微管蛋白二聚体聚合为微管，破坏细胞骨架、有丝分裂纺锤体与细胞内运输系统，扰乱寄生虫代谢并最终导致其死亡。但该类药物的不合理过量使用，直接推动了抗性的演化。苯并咪唑类抗性的分子机制是研究最为深入的领域，现有证据表明，同工型1 β-微管蛋白基因的点突变可通过氨基酸替换改变β-微管蛋白结构，阻碍药物结合。首个被证实与苯并咪唑类抗性相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）位于密码子200，即F200Y突变（TTC变为TAC），导致苯丙氨酸被酪氨酸替换。后续研究又发现密码子167（F167Y，TTC变为TAC）与密码子198（E198A，GAA变为GCA）的氨基酸替换也与抗性相关。除上述三个经典位点外，寄生虫线虫的同工型1与同工型2 β-微管蛋白中还报道了其他SNP，但密码子167、198、200的突变更占主导。苯并咪唑类抗性的遗传模式为常染色体半显性遗传，因此抗性表现为梯度特征而非绝对二元划分：携带一个突变等位基因与一个野生型等位基因的杂合子抗性低于两个突变等位基因的纯合子，仅两个等位基因均为野生的纯合子才表现完全敏感。
5. 5.
   驱虫药抗性检测
   现有胃肠道线虫药物抗性检测方法包括体内法（以粪便虫卵减少试验fecal egg reduction test, FECRT为核心）、体外法（如虫卵孵化试验egg hatch test, EHT与幼虫发育试验larval development test, LDT）与分子技术（以PCR与焦磷酸测序为主）。由于苯并咪唑类药物的作用机制特性，自动化幼虫迁移试验（automated larval migration assay, ALMA）与WMicrotracker等新型高通量体外技术不适用于该类抗性的检测。体内与体外方法均存在局限性：FECRT成本高、耗时长，个体间差异大，且宿主药物代谢动力学特征可能导致结果偏差，同时该方法仅反映治疗失败表型，受抗性以外的多种因素干扰，尽管新版指南已针对上述问题进行了优化，但仍无法完全规避缺陷；EHT与LDT的灵敏度不足，当抗性个体占比低于25%时易出现漏检，且潜伏期内有效剂量（ED₅₀）与致死浓度（LC₅₀）的日波动也会影响两类试验的稳定性。相比之下，分子技术的优势在于可直接定量田间样本DNA中的等位基因频率，若采用混合粪便样本，结果可准确反映群体层面的抗性现状。目前筛查SNP被认为是田间样本苯并咪唑类抗性检测最灵敏高效的方法，涵盖常规PCR、实时荧光定量PCR（real-time PCR/qPCR）、数字PCR（digital PCR, dPCR）、焦磷酸测序、深度扩增子测序（deep amplicon sequencing）及环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）等技术。

5.1 常规PCR与实时荧光定量PCR

常规PCR通过靶向寄生虫线虫苯并咪唑类抗性已知遗传标记的引物进行扩增，后经琼脂糖凝胶电泳可视化检测，可识别特异性DNA片段以判定抗性。已有多种基于该技术的方案用于检测单个毛圆科线虫的抗性个体，进一步结合限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）的PCR技术，可利用限制性内切酶根据目标SNP的存在与否选择性切割PCR产物，也已在苯并咪唑类抗性检测中成功应用。这类方法的局限在于依赖琼脂糖凝胶电泳判定单个线虫的等位基因状态，若要获得有统计学意义的等位基因频率数据，需对大量个体进行检测，耗时费力。实时荧光定量PCR可同步完成苯并咪唑类抗性等位基因DNA的扩增与定量，通过荧光探针或DNA结合染料实时监测扩增过程，实现DNA浓度的精准测定。但qPCR的抗性SNP检测受限于靶向性，仅能检测已表征的突变，且引物与探针结合位点的低丰度等位基因或多态性可能影响等位基因区分与频率估算的准确性。

5.2 数字PCR系统

数字PCR是标准qPCR的替代方案，可实现核酸的绝对定量。其核心原理是将样本分割为多个独立的PCR反应单元，每个分区包含0个或多个目标序列拷贝，扩增后通过荧光信号判定各分区的扩增状态：阳性分区代表成功扩增，阴性则无扩增。通过分析阳性分区的比例，结合泊松统计即可确定原始样本中目标序列的浓度，且具有统计学指定的准确度。样本分割可有效浓缩孤立微反应器内的目标序列，减少模板间竞争，从而能够检测野生型DNA背景下的罕见变异，并提升对抑制剂的耐受性。这种终点二分类检测模式，使数字PCR尤其适用于需要高灵敏度与低丰度靶标高精准定量的场景。商业化数字PCR系统采用不同的分割策略：最早开发的腔室数字PCR（chamber digital PCR, cdPCR）利用二维微腔室阵列分割反应混合物，热循环后通过荧光成像识别阳性反应；液滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）利用油包水乳液生成数千个纳升级液滴，经热循环后类似流式细胞术逐个进行荧光分析，研究显示经优化的qPCR检测可识别约1%的突变等位基因，而相同检测转换为ddPCR后，突变型与野生型的比例检测灵敏度可提升20000倍；近年还开发了纳米板数字PCR平台，将反应混合物均匀分配至密封板的数千个微孔中，全程封闭操作，最大限度降低污染风险，分区体积均一且工作流程简化，稳健性更强，更适合常规高通量应用。

5.3 焦磷酸测序

焦磷酸测序是目前最常用的SNP检测方法之一，属于实时测序技术，其原理为：脱氧核糖核苷三磷酸添加到延伸DNA链末端时释放无机焦磷酸（PPi），硫酸化酶利用焦磷酸生成ATP，后者被荧光素酶用于催化发光反应，反应产生的光量与掺入的核苷酸数量直接对应，由于每次添加的核苷酸种类已知，可据此读取DNA序列。该方法操作简便、速度快，且可在不显著增加时间与工作量的前提下同时分析多个SNP，适配性强。

5.4 深度扩增子测序

近年来，深度扩增子测序（常与用于虫种鉴定的混合扩增子 metabarcoding 联用）的关注度显著提升，高通量大规模平行测序技术的普及正推动抗寄生虫药物抗性监测领域的重大变革。深度扩增子测序的核心优势是可同时覆盖多个虫种与抗性标记。针对苯并咪唑类抗性的靶向深度扩增子测序流程为：首先PCR扩增目标区域（即捻转血矛线虫β-微管蛋白基因），随后利用二代测序技术（以Illumina平台为主）对扩增子进行深度测序，比对参考序列后估算群体内SNP的相对比例。该技术最初在英国绵羊场分离株中验证，目前已在全球范围内广泛应用：澳大利亚先后完成了绵羊与山羊群体的检测，加拿大开展了绵羊群体研究，莫桑比克完成了山羊群体分析，同时也拓展至其他动物与线虫种类。此外，该技术还可同时检测澳大利亚绵羊与山羊捻转血矛线虫的苯并咪唑类与左旋咪唑类抗性标记，实现了多抗性位点的同步筛查。

5.5 等温扩增技术

环介导等温扩增等温扩增技术利用具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst聚合酶），无需像常规PCR依赖Taq聚合酶的变温循环，可在恒定温度（通常为60-65℃）下完成反应。LAMP反应使用两对核心引物（内引物、外引物）与一对可选环引物，可结合目标区域的6个不同位点启动聚合。与PCR不同，LAMP扩增产物形成串联环状与哑铃状结构，每个扩增子均可提供新的聚合起始位点，每小时可积累10⁹拷贝的扩增产物，是目前应用最广的等温扩增技术。其终点检测方法多样，可根据现场检测需求与是否需定量灵活选择。针对捻转血矛线虫的检测，已实现比色法与侧向层析法的应用，也可通过荧光探针检测单碱基变化。LAMP也已成功适配苯并咪唑类抗性SNP检测，通过开发等位基因特异性引物，可在SNP存在时优先扩增，中国研究团队率先实现了捻转血矛线虫群体中E198A突变的检测，后续研究尝试同时检测苯并咪唑类抗性三个核心SNP，在合成DNA模板上取得了初步理想结果，但在田间样本应用中仍需克服部分局限性。

1. 6.
   不同地区抗性相关SNP的流行特征
   为明确捻转血矛线虫苯并咪唑类抗性相关多态性的全球分布，研究人员采用了多样化的分子技术与研究设计。部分研究以农场为单位，统计抗性等位基因频率超过设定阈值（如10%）的群体占比，评估农场层面的抗性流行率；部分研究针对寄生虫混合样本估算等位基因频率，从群体水平解析SNP的发生情况；还有研究对单个幼虫进行等位基因与基因型频率分析，评估抗性等位基因的固定程度。所有研究均靶向同工型1 β-微管蛋白基因的167、198、200三个核心密码子，不同数据集共同揭示了苯并咪唑类抗性的扩散范围与强度。欧洲地区F200Y突变始终是最主要的抗性相关SNP，F167Y与E198A的频率极低。瑞士与意大利的纵向数据显示，携带抗性等位基因的捻转血矛线虫群体占比随时间明显上升：瑞士东北部绵羊场中，F200Y突变频率≥10%的群体占比2012年为84.2%，2013年升至96.7%；意大利西南部同期仅为28.6%与44.4%。两地均未检测到F167Y与E198A频率≥10%的群体，但置信区间显示这两类突变仍以低水平存在。学界普遍认为，当群体内至少10%的个体携带抗性基因型时，即可判定该群体对苯并咪唑类药物产生抗性。北欧与中欧地区（如瑞典、奥地利）也呈现相同趋势：F200Y占绝对主导，其余突变零星出现。挪威2021-2022年对全国169个绵羊场的筛查显示，羔羊幼虫样本F200Y突变检出率为73%，母羊为69%，虽未统计寄生虫种群内的等位基因频率，但足以说明苯并咪唑类抗性已在挪威绵羊场广泛定植。欧洲以外地区也呈现类似规律：巴西塞阿拉州与加拿大的研究显示F200Y与F167Y均有检出，体现区域种群差异，整体仍以F200Y为主，F167Y散在分布，E198A极少检出。单个幼虫层面的分析进一步揭示了抗性群体的遗传构成：波黑与希腊的绵羊与山羊分离株几乎均为密码子200的纯合抗性基因型；巴西东北部塞阿拉州以F167Y为主，南部地区则以F200Y为主；中国分离株中F200Y与E198A均有检出，F167Y缺失；印度南部仍以F200Y为核心抗性标记，E198A低频存在。中国与印度的研究样本量相对较小，但仍可反映不同区域寄生虫种群在本地选择压下的独立抗性演化路径。波兰近期针对81个山羊群的大规模研究首次报道了当地山羊群中F200Y与E198A的高频率共存，与此前基于体内、体外方法的苯并咪唑类抗性流行率研究结果相互印证，填补了波兰山羊群SNP发生数据的空白。

讨论

随着抗寄生虫药物抗性在欧洲家畜胃肠道线虫中持续扩散，有必要在地方层面开展持续的监测与检测。针对捻转血矛线虫苯并咪唑类抗性相关突变的研究，相比其他药物类别与虫种，可更精准地揭示抗性的发生与扩散规律。苯并咪唑类药物的长期反复使用与剂量不足，无疑对线虫种群施加了强烈的选择压。捻转血矛线虫种群内极高的遗传变异是其快速演化出抗药性的基础，这种变异源于庞大的种群规模，为有效选择提供了条件。尽管F200Y突变在全球捻转血矛线虫种群中普遍存在，但F167Y与E198A的流行率存在显著区域差异。这种格局的一种合理解释是：两类突变在特定区域初始频率极低，后随牲畜流动广泛扩散。跨区域结果对比显示，尽管核心研究位点一致，但SNP流行模式差异显著，这很可能由本地用药习惯、驱虫频率、影响幼虫存活的气候条件、农场与区域间的牲畜流动与贸易等多因素共同驱动。抗性等位基因筛查是评估驱虫药疗效、制定适配防控策略的关键工具，鉴于牲畜贸易与流动的全球化，需开展跨国协调合作，完善抗性监测与管控体系。抗性等位基因的跨区域扩散凸显了协同监测项目与国家间信息共享的重要性，也进一步强调了开发标准化分子诊断方法的迫切性。通过推动全球合作与数据共享，可更高效地应对新发抗性，保护驱虫药的长期有效性，帮助利益相关方预判潜在风险并提前干预。除环境与管理因素外，解读区域SNP流行模式时也需考虑方法学差异，数字PCR、焦磷酸测序、qPCR等分子工具的检测性能会影响低频率抗性等位基因的识别能力。与传统体内外试验相比，分子技术在苯并咪唑类抗性检测中更快、更灵敏、更可靠，将分子诊断整合到常规监测体系中，可更早识别抗性群体，更准确评估种群抗性水平。此外，捻转血矛线虫的可持续防控不能仅依赖药物手段，需结合微环境避难所管理、战略放牧与生物防控等措施，降低寄生虫种群的选择压。这些非化学策略不仅能辅助驱虫药治疗，还可延长药物有效期，支撑更可持续、环境友好的寄生虫防控体系。

结论

捻转血矛线虫的苯并咪唑类抗性是小型反刍动物生产中普遍且持续演化的挑战。尽管F200Y始终是最核心的抗性关联标记，但F167Y与E198A的区域流行差异凸显了本地化监测的必要性。在此背景下，将分子与遗传学工具整合到常规抗性监测中已不仅是优化选项，而是必然要求，其可实现抗性群体的早期识别、抗性等位基因频率的精准估算与治疗策略的及时调整。当分子监测与审慎用药、非化学防控措施相结合时，可支撑循证寄生虫管控，优化抗性管理，保障现有驱虫药的长期有效性。

CRediT作者贡献声明

Rare?-Constantin Bejenariu：文稿审阅与编辑；Kinga Biernacka：文稿审阅与编辑、方法学；Aija Mālniece：文稿审阅与编辑、形式分析；Karolina Radziejewska：文稿审阅与编辑；Alistair Antonopoulos：文稿审阅与编辑、初稿撰写、数据整理、概念化；Marcin Mickiewicz：文稿审阅与编辑、初稿撰写、概念化；Adrian-Valentin Pot?rniche：文稿审阅与编辑；Jaros?aw Kaba：文稿审阅与编辑、初稿撰写、验证、监督、概念化；Zofia Nowek：初稿撰写、方法学、调查、形式分析、概念化。

未引用参考文献

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