利用高效逆流膜纯化技术对体外转录产生的mRNA进行连续纯化

《Biotechnology and Bioengineering》：Continuous Purification of mRNA Produced by In Vitro Transcription Using High Performance Countercurrent Membrane Purification

　　

信使核糖核酸（mRNA）药物经体外转录（IVT）生产后必须进行纯化，以去除残留的酶类和游离核苷酸。本研究考察了高效逆流膜纯化（HPCMP）技术在mRNA药物纯化中的应用，该技术基于mRNA与杂质在半透性聚醚砜（polyethersulfone, PES）中空纤维膜上扩散速率的差异实现分离。研究人员采用两种模型mRNA分子，以胞苷三磷酸（cytosine triphosphates, CTPs）和蛋白酶K（Proteinase K）作为模型杂质进行了实验。HPCMP在60 min停留时间条件下实现了99.7%的CTP去除率，且未检测到可测量的mRNA损失。由于带正电荷的蛋白酶K与带负电荷的mRNA之间存在络合作用，HPCMP对蛋白酶K的去除率在mRNA存在时有所降低；该效应通过动态光散射（dynamic light scattering, DLS）和搅拌式超滤置换实验得到了独立验证。HPCMP工艺可连续运行超过24 h，未发生膜污染，mRNA收率保持稳定（>97%），蛋白酶K去除率亦保持稳定（>94%）。上述结果明确证明了利用HPCMP进行mRNA药物连续纯化的可行性。

mRNA作为一种新型治疗性生物大分子，因其临床适用性广泛且研发周期短而展现出巨大应用前景。与传统生物制品相比，mRNA药物具有成本效益高、生产工艺相对简便等优势，可针对感染性疾病、代谢性疾病、遗传性疾病及心血管疾病等多种病症。目前，mRNA药物主要通过体外转录（IVT）技术生产，即利用RNA聚合酶以线性化DNA模板为指导，将核苷三磷酸（nucleotide triphosphates, NTPs）组装为目标mRNA分子。然而，IVT反应产物（即IVT粗品）中除目标mRNA外，还含有残留核苷酸、DNA模板、RNA聚合酶以及多种产物相关杂质（如双链RNA和截短片段），这些杂质必须通过下游纯化工艺予以去除，以确保最终产品的安全性、稳定性及有效性。

膜分离技术在mRNA药物纯化中发挥着重要作用。现有下游工艺通常包含多个膜分离单元操作，用于产物浓缩、低分子量杂质去除、缓冲液置换以及最终产品的除菌过滤等目的。然而，传统膜分离单元操作多以批处理模式进行，物料在切向流过滤（tangential flow filtration, TFF）模块中连续循环，直至达到目标浓度和/或纯化倍数。批处理操作导致物料停留时间分布宽泛，且长时间暴露于剪切力和泵送作用中，可能降低产品质量和收率。

近年来，连续化与集约化生物工艺加工技术日益受到关注，该技术可降低资本设备投入和车间占地面积、提高生产效率、增强生产灵活性并改善产品质量。针对mRNA生产，特别是mRNA疫苗生产需求波动大的特点，开发集成式连续现行药品生产质量管理规范（current Good Manufacturing Practice, cGMP）平台具有重要战略意义，可实现便捷的规模放大/扩展以满足市场需求变化。

已有若干研究探索了可整合于mRNA制造流程的连续工艺。例如，单程切向流过滤（single-pass tangential flow filtration, SPTFF）技术已被用于IVT粗品中mRNA的连续浓缩，但纯化效果有限；基于沉淀与切向流过滤组合的连续纯化工艺虽减少了样品预处理需求，但需使用大量聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG），后续仍需额外步骤将其去除；另有研究开发了基于TFF、连续层析、脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）制剂及冻干的全流程连续制造数字孪生软件，但连续层析在mRNA纯化中的应用仍面临挑战。

逆流膜接触技术因其低剪切操作、无需预处理、可直接处理IVT粗品（无需如连续沉淀工艺中的添加剂）等优势，在mRNA连续加工中具有显著吸引力。逆流透析技术已用于慢性肾病治疗超过半个世纪，中空纤维膜可实现高达90%的尿素单次通过去除率，并可有效清除β2-微球蛋白（分子量约12 kDa）等低分子量蛋白质。近期研究表明，逆流透析可有效用于生物制药产品连续加工中的缓冲液置换。类似地，高效逆流膜纯化（HPCMP）技术通过利用半透膜的高选择性扩散传输，已实现肌红蛋白（分子量17 kDa）与牛血清白蛋白（分子量67 kDa）的高分辨率分离；后续研究进一步证实HPCMP可有效去除中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary, CHO）细胞来源的宿主细胞蛋白（host cell proteins, HCPs），在单克隆抗体纯化中实现>95%的HCP去除率和95%的抗体收率。此类系统在无显著压力驱动过滤条件下运行，显著减少了膜污染，实现了长期连续操作而无需更换或清洗膜组件。此外，HPCMP相比传统批处理透析过滤和亲和层析技术，可减少缓冲液消耗量。

本研究旨在考察HPCMP在mRNA药物连续纯化与缓冲液置换中的应用潜力。研究人员采用商品化改性聚醚砜（modified polyethersulfone, mPES）中空纤维超滤膜（标称分子量截留值为100 kDa），以CTP为对象确定适宜的操作条件范围，并以蛋白酶K与纯化mRNA的二元混合物考察分离效果。

该研究由美国食品药品监督管理局（US FDA）资助，mRNA样品由Arranta Bio（现属ReciBioPharm）提供。主要技术方法包括：（1）高效逆流膜纯化系统：采用MicroKros模块（含6根中空纤维，内径0.5 mm，有效长度20 cm，有效膜面积20 cm2），通过控制进料流率（注射泵）和接收液进出口流率（双通道蠕动泵实现逆流接触），在40 mM Tris缓冲液（pH 7.4）体系中进行连续纯化；（2）恒通量透析过滤实验：采用Amicon 8010搅拌式超滤池（Biomax 100 kDa膜）进行对比验证；（3）动态光散射分析：采用Malvern Zetasizer Nano ZS90测定分子间相互作用；（4）色谱分析：包括尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）用于核苷酸浓度测定、离子对反相高效液相色谱（Ion Pair Reverse Phase high-performance liquid chromatography, IP-RP HPLC）用于mRNA传输行为与完整性评价、以及阳离子交换色谱（cation exchange chromatography, CEX）用于含mRNA体系中蛋白酶K的定量检测。

**NTP去除**：初始HPCMP实验以2 mM CTP溶液为模型，考察了不同流率下的去除效果。结果表明，在α（接收液与进料流率之比）= 4的条件下，CTP去除率随进料流率增加而降低（即随停留时间缩短而降低）。基于中空纤维有效容积计算，当进料流率为0.01 mL/min时，对应停留时间为24 min；而当进料流率降至4 μL/min（对应停留时间60 min）时，HPCMP实现了99.7%的CTP去除率。在含0.2 mg/mL自扩增RNA（self-amplifying RNA, saRNA）的2 mM CTP溶液中，CTP去除率与无mRNA时一致（q_F = 0.01 mL/min条件下，实测R = 92±2%，理论值89%），表明游离核苷酸与mRNA之间无相互作用，且mRNA对膜几乎无污染。研究人员建立了基于逆流接触器理论的数学模型，通过最小二乘法拟合确定总传质系数k_o = 2.2±0.1×10^-7 m/s，模型计算值与实验数据高度吻合（R² > 0.99，均方根误差1.4%）。

**蛋白酶K去除**：以0.2 mg/mL蛋白酶K溶液为对象的HPCMP实验显示，其去除率同样随进料流率增加而降低。拟合得到蛋白酶K的总传质系数k_o = 1.1±0.1×10^-7 m/s，模型拟合良好（R² > 0.98）。值得注意的是，在0.2 mg/mL荧光素酶（firefly luciferase, Fluc）mRNA存在时，蛋白酶K去除率（R = 49%）显著低于蛋白酶K单独存在时（R = 62%）及模型预测值（R = 63%），提示mRNA与蛋白酶K间存在相互作用。

**传质分析**：研究人员对传质行为进行了理论分析。根据纯扩散传输理论估算的膜传质系数（k_m = 6.2×10^-7 m/s）约为CTP实测值的三倍，表明纤维管腔和/或壳程外边界层对总传质阻力有显著贡献。尽管蛋白酶K与CTP的体相扩散系数相差六倍（分别为0.83×10^-10方案和5.0×10^-10 m2/s），但两者的总传质系数仅相差约两倍。这可能归因于多种因素：带负电荷的CTP与膜表层负电荷孔道间的静电排斥降低了分配系数；或壳程边界层阻力在总传质阻力中占主导地位而使传质系数对溶质扩散系数的依赖性减弱。

**蛋白酶K-mRNA相互作用**：针对mRNA存在时蛋白酶K去除率降低的现象，研究人员提出假设：带正电荷的蛋白酶K（等电点pI = 8.9）与带负电荷的mRNA存在分子间静电相互作用。动态光散射实验证实了这一假设：纯蛋白酶K（6 mg/mL）呈单峰分布，平均粒径约6 nm；纯saRNA（0.5 mg/mL）呈单峰分布，平均粒径73 nm；而两者二元混合物仅呈现一个略大于saRNA单独的峰，无游离蛋白酶K信号。平行实验采用带负电荷的牛血清白蛋白替代蛋白酶K，二元混合物中呈现两个独立峰，反证了蛋白酶K与saRNA间的强相互作用主要为静电性质。

搅拌式超滤池恒通量透析过滤实验进一步量化了该相互作用。在60 L/m2/h通量条件下，纯蛋白酶K的观测筛分系数（observed sieving coefficient, S_o）为0.90±0.03；而在Fluc mRNA存在时，S_o降至0.65±0.02。鉴于蛋白酶K-mRNA复合物可被100 kDa膜完全截留，该结果表明约30%的蛋白酶K与mRNA形成了复合物。

**含mRNA体系中蛋白酶K的去除**：对含等量蛋白酶K和Fluc mRNA（均为0.2 mg/mL）的二元混合物进行HPCMP实验（q_F = 0.005 mL/min，α = 4），阳离子交换色谱分析显示约80%的蛋白酶K被去除。在更宽流率范围内的系统研究表明，当考虑部分（可逆）络合效应时，模型预测与实验数据高度吻合（R² > 0.99，均方根误差2.1%），其中游离分数f = 0.28由透析过滤实验确定。模型预测表明，采用q_F = 0.0014 mL/min和α = 4的条件可实现99%以上的蛋白酶K去除，且HPCMP工艺较批处理透析过滤可减少43%的缓冲液用量。

**HPCMP工艺性能评估**：HPCMP的核心优势在于可在稳态条件下连续运行，且膜污染极轻微。在q_F = 0.002 mL/min、α = 4条件下对蛋白酶K/Fluc mRNA二元混合物进行25 h连续运行实验，结果显示：运行3 h时残余蛋白酶K浓度降至初始值的3.6%（含装置死体积稀释和HPCMP去除的双重贡献）；6 h后蛋白酶K去除率达到稳定，维持>94%的水平超过25 h；mRNA收率在装置死体积置换完成后趋于稳定，最后15 h维持>98%。IP-RP HPLC分析证实，进料与产物中的mRNA峰形几乎完全一致，无mRNA降解证据；收集液中仅检出约0.3%的mRNA，与产物中mRNA峰高的微小降低一致。

**讨论与结论**：本研究首次证实了HPCMP用于mRNA药物纯化的可行性。采用商品化100 kDa mPES中空纤维膜，HPCMP可有效去除小分子杂质（CTP）和酶类杂质（蛋白酶K）。通过调节操作流率（即调控停留时间）可优化杂质去除效率。经典逆流接触模型可准确预测小分子去除行为；而对于蛋白酶K，需考虑其与mRNA的可逆络合效应，将结合分数纳入模型后同样获得优异的预测效果。HPCMP作为低剪切的连续单次通过工艺，经IP-RP色谱证实不会造成mRNA降解，且连续运行超过24 h性能无衰减，体现了该扩散型工艺在抗膜污染方面的优势。研究人员同时指出，本研究采用的mRNA浓度（0.2 mg/mL）低于工业典型滴度（2–5 mg/mL），未来需进一步考察更高mRNA浓度及其他IVT粗品杂质（如亚精胺等多价阳离子）对HPCMP工艺的影响，以实现该技术在mRNA制造全流程中的直接整合。

研究结论部分指出：本研究数据首次证明高效逆流膜纯化（HPCMP）可用于信使核糖核酸（mRNA）药物的纯化。研究采用商品化100 kDa标称分子量截留值的改性聚醚砜中空纤维膜进行HPCMP，实现了对胞苷三磷酸（CTP）和蛋白酶K（一种在Comirnaty疫苗生产中用于降解DNase和残留T7 RNA聚合酶的蛋白水解酶）的高效去除。杂质去除效率可通过增加膜模块内停留时间（即降低进料流率）来提高。小分子核苷酸去除数据与经典逆流接触模型预测高度吻合。与此相反，由于mRNA存在时带正电荷的酶与带负电荷的mRNA形成可逆复合物，蛋白酶K去除率有所降低。该相互作用经动态光散射独立证实，并通过恒通量透析过滤实验进行了定量表征。将结合分数纳入逆流接触模型后，可在宽泛的操作条件范围内与实验数据获得优异的一致性，为确定既能有效去除小分子杂质（如游离核苷酸）又能有效去除残留酶类（如蛋白酶K）的操作条件提供了简洁的理论框架。HPCMP作为低剪切条件下的单次通过连续工艺，经离子对反相色谱检测未引起mRNA降解。此外，连续运行超过24 h性能无衰减，表明该扩散型工艺中膜污染可忽略不计，这与前期研究结果一致。但需注意，本研究采用的mRNA浓度（0.2 mg/mL）低于典型工业滴度（约2–5 mg/mL），该较低浓度系因纯化mRNA样品供应有限所致。HPCMP性能应基本与mRNA浓度无关，尽管更高浓度的进料将为扩散提供更大的浓度推动力。另外，考察IVT粗品中其他杂质（如亚精胺等多价阳离子）对HPCMP工艺的影响亦十分重要。未来研究需进一步评估mRNA浓度和杂质水平对HPCMP工艺的影响，并证明HPCMP作为mRNA制造全流程连续工艺组成部分的直接整合可行性。