综述：重组腺相关病毒生产中“理想”细胞系的决定因素

《Biotechnology and Bioengineering》：What Makes an “Ideal” Cell Line for Recombinant Adeno-Associated Virus Production?

　　

重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）已被广泛用作体内递送基因治疗产品的首选载体。然而，当前rAAV生产系统存在若干不足，难以满足持续增长的临床需求。迄今为止，已有8种不同的宿主细胞系统被用于生产rAAV，其中某些细胞系具有使其更适于rAAV制造的特征。本文综述了这些特征，以及其他已被证实可提高rAAV生产力的改造策略，以形成关于rAAV生产“理想”细胞系可能具备何种特征的共识。在此基础上，研究人员阐述了有助于识别并开发新型宿主细胞系统的关键特征，以支持基于rAAV的基因治疗产品实现广泛应用。

1 Introduction

1.1 Adeno-Associated Viruses

文章首先概述了腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）的基本病毒学特征。AAV属于细小病毒科（Parvoviridae），为无包膜二十面体病毒，携带约4.7 kb的单链基因组。其基因组包含rep与cap两个核心基因，两侧由反向末端重复序列（inverted terminal repeats，ITRs）夹持，后者对于病毒基因组复制、包装以及表达至关重要。rep基因在不同启动子驱动下编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40等复制相关蛋白；cap基因则经可变剪接及不同起始密码子使用产生衣壳蛋白VP1、VP2、VP3，以及膜相关辅助蛋白（membrane-associated accessory protein，MAAP）和装配激活蛋白（assembly-activating protein，AAP）。cap基因不仅决定AAV血清型，也决定其组织嗜性。天然及工程化AAV衣壳已具备对肝脏、神经、视网膜和肺等多类组织的靶向能力。

在基因治疗应用中，重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）因其低致病性、广泛嗜性和低免疫原性而成为主流体内递送载体。rAAV通常以目的基因替代野生型病毒中的rep和cap编码区，同时保留驱动体内表达所需的调控元件。文章指出，尽管rAAV疗法获批数量不断增加，但现有生产体系仍面临可扩展性不足、空衣壳比例高、难以满足系统给药所需高剂量需求以及GMP级质粒和转染试剂成本高昂等问题。因此，作者提出，宿主细胞是影响rAAV产量、质量与工艺经济性的关键变量，值得作为工艺优化核心进行系统分析。

1.2 Current Hosts Used for rAAV Production

本节系统梳理了目前已用于rAAV生产的8类宿主细胞系统，并比较其优缺点。

1.2.1 HEK293 Cells

HEK293细胞是当前最常用的rAAV生产宿主。该细胞系源于人胚肾细胞，经腺病毒5型（adenovirus 5，Ad5）DNA片段转化获得，并稳定整合了E1A和E1B相关序列。E1A作为关键转录调控因子可支持辅助功能表达，E1B编码产物则具有抗凋亡作用，这种背景使HEK293天然适配腺病毒辅助型rAAV生产体系。基于此，三质粒转染成为临床级rAAV制备的经典平台：分别提供含ITRs和治疗转基因的病毒基因组质粒、提供E2A/E4orf6/VA RNA等辅助基因的helper质粒，以及提供rep/cap的第三质粒。悬浮适应HEK293细胞的应用在一定程度上改善了工艺放大能力。

在此基础上，文章进一步讨论了若干改良体系。AAVone系统将rep/cap、辅助基因及ITR-转基因盒整合至单一大质粒中，可较传统三质粒法提高产量，但也伴随污染DNA谱变化。加入人博卡病毒1型（human bocavirus 1，HBoV1）NP1和NS2基因也能提升产量，提示辅助模块的精准重构具有重要价值。此外，HEK293衍生包装细胞系和生产细胞系也被开发，以降低GMP级质粒依赖，但持续性Rep表达的细胞毒性曾长期制约相关进展。文章还介绍了基于自抑制辅助腺病毒的TESSA系统，该系统通过四环素调控主要晚期启动子（major late promoter，MLP）活性，在降低辅助病毒污染的同时显著提升rAAV产量与体外转导效率，显示出较高的产业化潜力。

1.2.2 Sf9 Cells

Sf9细胞来源于昆虫秋粘虫卵巢组织，是基于杆状病毒表达载体（baculovirus expression vector，BEV）的rAAV生产平台核心宿主。早期系统依赖3个重组杆状病毒共同感染，后续逐渐发展为Two-Bac、Mono-Bac和One-Bac等简化形式，其中Mono-Bac报道了较高体积产量。尽管Sf9平台在放大潜力和生物安全方面具有优势，但不同研究对于其产品质量评价并不一致。一些结果显示，Sf9来源rAAV可能存在衣壳翻译后修饰差异、VP1/VP2比例降低、满壳/空壳比不理想及感染性下降等问题；另一些研究则认为该平台在满壳比例、体外表达和体内转导上具有优势。作者据此指出，不同实验室和分析体系间的差异使跨平台比较复杂化，也说明“理想”细胞系的判断不能仅依据单一产量指标。

1.2.3 HeLa Cells

HeLa是经典的人源永生化细胞系，曾用于多种rAAV研究与临床材料生产。其优势在于人源背景及较成熟的细胞工程基础，既可用于转染法，也可构建包装/生产细胞系。文中提到，E1转化的HeLa衍生系结合重组痘苗病毒与缺失E1/E3的腺病毒，可实现较高rAAV产量，并可能因衣壳中VP1含量升高而改善转导能力。近年来也有HeLaS3稳定生产细胞系被报道。然而，该平台面临的核心障碍是基因组中HPV18来源E6/E7病毒癌基因可能被误包装，从而带来显著安全与监管顾虑，限制了其广泛商业应用。

1.2.4 CHO Cells

中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）是生物制药中最成熟的工业宿主之一，监管接受度高。文章指出，若CHO可用于rAAV生产，将在法规与产业实施方面具有明显优势。但现有转染法在CHO中的rAAV产量很低，提示非人源细胞与腺病毒辅助系统之间可能存在兼容性问题。采用表达疱疹病毒进入介质（herpesvirus entry mediator，HVEM）的CHO细胞，并使用两种重组单纯疱疹病毒（recombinant Herpes Simplex Virus，rHSV）提供生产元件，可将产量提升至10⁹–10¹⁰ vg/mL量级，说明辅助系统与宿主来源之间的匹配对平台构建至关重要。

1.2.5 BHK Cells

幼仓鼠肾细胞（baby hamster kidney cells，BHK）也曾用于临床试验级rAAV生产，通常采用两个rHSV共感染体系分别提供ITR-转基因盒与rep/cap。该体系可实现较高产量，后续还被改造为无动物源副产物流程，显示出一定工艺成熟度。不过，文章也提示该体系对rHSV稳定性存在顾虑，且整体应用范围不如HEK293广泛。

1.2.6 A549 Cells

A549来源于肺癌组织，曾被用于构建rAAV包装细胞系和悬浮生产细胞系。其优势在于可建立稳定系统并获得较高单位细胞产量，但该方向自早期研究后发展有限，尚未形成主流工业平台。

1.2.7 HAT Cells

HAT细胞是为先进治疗药物（advanced therapeutic medicinal product，ATMP）制造而专门开发的人羊膜上皮细胞系，经人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）永生化并稳定整合Ad5 E1基因。悬浮适应的HAT克隆可在多种血清型中实现10¹⁰–10¹¹ vg/mL产量，并表现出优于HEK293来源材料的体外转导率和满壳/空壳比，提示其可能是较具前景的新型宿主。但该平台尚缺乏GMP级广泛应用验证。

1.2.8 Yeast

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）也可通过稳定表达Rep、Cap和AAP构建rAAV生产株。其培养简便、成本低廉，但当前产量较低，限制了进一步应用。

2 Desirable Traits for rAAV Production

在回顾各宿主系统后，文章提出“理想”rAAV生产细胞系应具备的关键特征，并结合HEK293中的化学或遗传改造研究加以论证。

2.1 Stable Integration of E1 Genes

稳定整合并表达Ad5 E1相关基因是支持腺病毒辅助型rAAV生产的重要条件。缺失这些基因会显著降低产量，而整合位点重复及表达水平调控可能进一步影响生产性能。作者认为，除HEK293外，其他E1互补细胞系也值得探索其在rAAV生产中的适用性。

2.2 Transfection Efficiency

对于转染型生产工艺，高而稳定的转染效率是关键前提。细胞系间在摄取复合物、胞内运输及核转运能力方面存在差异，这些因素共同决定可转染性。DNA核靶向序列（DNA nuclear targeting sequences，DTS）可能通过促进质粒入核提高非分裂细胞转染效率，但其在rAAV生产中的价值尚未得到充分验证。

2.3 Ability to Grow in Chemically Defined Medium and Suspension Culture

可在化学成分明确培养基（chemically defined medium，CD medium）和悬浮培养条件下生长，有助于提升批次一致性、减少外源污染风险并增强放大能力。不过，文章指出，从贴壁向无血清悬浮状态的适应可能显著改变细胞特性，甚至降低单位细胞产量，因此不能将悬浮化简单视为绝对优势。微载体培养则被提出为兼顾贴壁高生产力与悬浮工艺可扩展性的替代方案。

2.4 Cell Cycle Activity

作者强调，细胞周期调控状态是决定rAAV高产的重要内在特征之一。高产细胞群体表现出细胞周期进程减弱及相关基因表达重塑。多项研究也证明，胸苷、诺考达唑、HMN-214等诱导G₁/S或G₂/M阻滞的干预可提升rAAV产量。这说明“理想”细胞系未必是增殖最快的细胞，而可能是能够在生产阶段适度减缓细胞周期、将资源转向病毒复制和包装的细胞。

2.5 Secretory Capacity

较强的分泌能力可促进rAAV释放至上清，简化下游纯化并降低成本。文章指出，MAAP可能参与rAAV与细胞外囊泡相关的分泌过程。敲除syntaxin-7（STX7）和Synaptosome associated protein 23（SNAP23）等SNARE蛋白可增加上清中的rAAV产量，机制上可能与阻断晚期内体和溶酶体融合、促进回收内体途径释放有关。氯喹抑制内体酸化也显示出类似促进作用。

2.6 Resistance to Apoptosis

rAAV生产过程，尤其是基于聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）的转染，可诱导HEK293细胞发生半胱天冬酶（caspase）介导的凋亡。BAX/BAK1敲除或使用Z-VAD-FMK等凋亡抑制剂均可改变产量或满壳/空壳比，说明抗凋亡能力是影响产量与质量的重要调节点。

2.7 Diminished Activity of Immune and Inflammatory Pathways

转染型rAAV生产会诱导先天免疫、干扰素及炎症相关基因表达。低产克隆中JAK/STAT相关通路活性更高，而JAK1/JAK2抑制剂鲁索替尼（ruxolitinib）可提升产量。这提示具备较弱抗病毒应答的宿主细胞，或经过定向抑制这些通路的工程化细胞，更适于rAAV高效生产。

2.8 Cell Metabolism

rAAV生产高度依赖能量与代谢前体供应。代谢资源在细胞生长、病毒蛋白表达、基因组复制和包装间的分配，将直接影响载体产量与质量。抑制缺氧诱导因子1-α（hypoxia-inducible factor 1-α，HIF-1α）虽可提升衣壳水平，却会降低病毒基因组产量和满壳比例，说明代谢工程需要同时兼顾数量与质量终点。

2.9 Absence of Viral Oncogenes

理想宿主还应尽可能避免携带可被误包装的病毒癌基因。HeLa中的E6/E7及HEK293中的E1相关序列均涉及潜在安全风险。尽管某些病毒基因对高产是必要的，但其存在将增加质量控制和监管评估压力。

2.10 Origin and Availability

细胞来源不仅影响与辅助系统的相容性，也关系到产品生物学性质、商业可获得性及知识产权限制。不同来源宿主产生的rAAV在理化特征和生物效力上可能存在差异，因此宿主选择必须结合工艺、法规和供应链综合评估。

2.11 Favorable Impurity Profiles

理想细胞系还应产生更有利的杂质谱，包括较低的宿主细胞DNA（host cell DNA，hcDNA）、宿主细胞蛋白（host cell protein，HCP）、误包装DNA、空壳及部分装载衣壳。不同宿主在这些指标上差异明显，若上游阶段即可形成高满壳比例、低杂质负荷的产物，将显著减轻下游纯化压力并提升整体制造鲁棒性。

3 Conclusion and Future Outlook

文章最后指出，随着rAAV基因治疗需求持续增长，开发更高效、更可放大的生产宿主与工艺体系已成为产业关键。HEK293仍是当前标准平台，但CRISPR等基因编辑工具使研究者能够更精准地重塑宿主细胞特征。作者认为，理想细胞系应综合具备稳定辅助功能、较优转染适配性、无血清悬浮培养潜力、受控细胞周期、增强分泌能力、抗凋亡特征、较弱抗病毒通路活性、适配的代谢状态、较低安全风险以及良好杂质谱等“细胞指纹”。未来研究还应关注这些特征之间的协同关系，例如凋亡抑制与细胞周期减缓的联动、分泌增强与杂质谱改善的关联，以及小规模发现能否转化至大规模生物反应器生产。总体而言，本文并非提出单一最佳宿主，而是构建了一个面向rAAV制造的系统性评价框架，为后续定制化高性能生产细胞系的开发提供了明确方向。