受控补料促进三元聚羟基脂肪酸酯稳健生产工艺的开发

《Biotechnology Journal》：Controlled Feeding Facilitates the Development of a Robust Production Process for Terpolymeric Polyhydroxyalkanoates

　　

聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHAs）是一类具有前景的可生物降解且可持续的生物聚合物。然而，当前PHA的应用仍受其可获得性有限的制约，这一现状尤为可惜，因为诸如共聚物或三元共聚物等新型PHA变体有望提供更优的材料性能。本研究报道了利用Cupriavidus necator生产具有高3-羟基戊酸（3-hydroxyvalerate，3HV）含量的聚（3-羟基丁酸-共-3-羟基戊酸-共-4-羟基戊酸）[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxyvalerate)，PHBVV]三元聚合物。研究人员成功实施并验证了一种基于pH与pO₂信号的全受控补料策略，分别在7.5 L和42 L生物反应器中实现了对生长抑制性底物乙酰丙酸（levulinic acid，LA）的受控递送。研究获得的最大生物量为40.2 ± 0.9 g L^?1，其中PHA占细胞干重（cell dry weight，CDW）的75%，对应产率为0.32 ± 0.02 g_PHA g_LA^?1。重要的是，该工艺在两个生产尺度上均实现了高3HV含量（38%–46%）和4HV含量（1%–2%）的PHBVV生产。除证明PHBVV可在搅拌罐式生物反应器中进行可放大生产外，本研究还提供了一个系统而全面的对比数据集，包括比生长速率、底物摄取速率、产率系数以及呼吸活性。本文结果既构成了PHBVV生产放大与过程自动化的方法学框架，也为未来PHA生物工艺的优化提供了有价值的参考。

该论文发表于《Biotechnology Journal》，聚焦于可生物降解聚酯聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHAs）的工艺开发与放大问题。PHAs是微生物在碳源过量而营养受限条件下合成的胞内储碳储能物质，其中聚3-羟基丁酸（poly(3-hydroxybutyrate)，PHB）最具代表性，但PHB本身存在脆性大、加工温度窗口窄等局限，限制了其广泛应用。相较之下，含3-羟基戊酸（3-hydroxyvalerate，3HV）和4-羟基戊酸（4-hydroxyvalerate，4HV）的共聚或三元聚合物可显著改善材料热学与加工性能，尤其4HV即使少量掺入，也可明显降低熔点。因此，聚（3-羟基丁酸-共-3-羟基戊酸-共-4-羟基戊酸）[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxyvalerate)，PHBVV]被视为具有重要应用潜力的新型PHA材料。

然而，PHBVV的实际制备长期受限于前体底物选择与工艺稳定性。能够引入HV单元的前体，如4-羟基戊酸、4-戊内酯和乙酰丙酸（levulinic acid，LA），普遍具有较强抑制性；其中4-羟基戊酸不易获得，4-戊内酯虽可得到理想单体组成，但现有研究多停留于摇瓶水平，且底物抑制显著，均不利于建立稳定可放大的生产过程。LA则兼具可行性与研究基础，既可作为4HV前体，也可经代谢途径生成3HV和3HB单元，因此为PHBVV合成提供了单一碳源方案。但LA同样具有抑制作用，必须通过精准补料避免局部高浓度和代谢失衡。基于这一背景，研究人员以能够利用葡萄糖且保留PHBVV合成能力的Cupriavidus necator NCIMB 11599为生产菌株，目标是系统解析PHBVV生产过程各阶段特征，建立基于pH与溶解氧（pO₂）信号的全自动受控补料策略，并完成由7.5 L到42 L搅拌罐式生物反应器（stirred tank reactor，STR）的工艺转移。

在技术方法上，研究主要采用以下关键手段：首先构建两级种子扩培体系，统一接种于后指数期以提高发酵重复性；其次在7.5 L玻璃反应器与42 L不锈钢反应器中进行分阶段发酵，以葡萄糖支持生物量增长、以LA驱动PHBVV合成；再次开发基于pH-pO₂-stat的双通道补料控制，并通过单侧/双侧搅拌级联切换实现对抑制性底物的按需供给；同时结合尾气分析计算氧摄取速率（oxygen uptake rate，OUR）与二氧化碳排放速率（carbon exhaust rate，CER），并通过产率系数、比摄取速率、比生长速率和时空产率（space-time yield，STY）对过程进行表征；最后依据单位体积总比功率输入（P_t）并辅以体积传氧系数（kL a）与混合时间（t_m）实施放大分析。

**1 Introduction**

论文首先从材料学需求出发，阐明PHBVV的研究价值。作者指出，PHA单体组成由菌株代谢能力与碳源共同决定。C. necator天然可合成短链至中短链PHA，但野生型H16存在葡萄糖摄取缺陷，因此NCIMB 11599作为葡萄糖可利用突变株更适于构建经济工艺。作者进一步梳理了LA转化为3HB、3HV和4HV的代谢路线：LA经辅酶A（coenzyme A，CoA）活化后，可通过不同分支形成levulinyl-CoA衍生中间体，最终在PHA合酶PhaC催化下聚合为PHBVV。文中强调，3HB与3HV的比例与三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）及甲基TCA循环活性密切相关，这为后续解释聚合物组成变化提供了代谢基础。研究缘起在于：现有关于PHBVV的STR生产研究有限，尤其缺乏既能抑制LA毒性、又可直接用于放大的自动化补料工艺。

**3.1 Evaluation of Growth Behavior During Preculture Cascade**

研究人员首先评估种子扩培阶段在葡萄糖矿盐培养基中的生长行为，以保证发酵起始生理状态一致。6次独立实验显示，该菌在8–20 h进入指数生长期，最大比生长速率为0.194 ± 0.005 h^?1，因此将17–19 h的后指数期种子作为统一接种窗口。结果说明，标准化种子状态是后续PHA工艺重现性的前提。作者还观察到摇瓶中约22 h后虽进入稳定期，但葡萄糖未完全耗尽，提示无pH控制条件下酸化可能抑制后续生长。

**3.2 Control Strategy for Stirrer and Substrate Feeding**

这是全文工艺创新的核心部分。研究人员指出，传统双侧搅拌控制会在底物耗尽、细胞呼吸下降时自动降低转速，从而掩盖pO₂上升信号，延迟pO₂触发补料，造成饥饿期。为解决这一问题，作者建立“部分单侧搅拌级联控制”：在Feed 1触发前限制转速下调，使底物耗尽引起的pO₂上升能够及时突破阈值并激活补料。Feed 1为经NaOH中和至pH 7的50%（w/v）LA，按pO₂信号脉冲式加入；Feed 2为70%（w/v）、pH 1.8的LA，作为pH调节酸源连续补加。作者又引入补料后适应时间t_Adapt，用于防止加料后pO₂波动造成误触发，并使搅拌系统在后续阶段逐步适配较低氧需求。该控制逻辑实现了以pO₂反映碳源耗尽、以pH反映酸性底物消耗的双信号耦合，为抑制性有机酸补料提供了可迁移方案。

**3.3 Process Characterization in the Lab Scale**

在7.5 L反应器中，研究人员将工艺划分为葡萄糖生物量增长阶段、LA生物量增长阶段和PHA积累阶段三部分。这样设计的原因在于：通过初始培养基设定C/N比为5，使氮源仅在葡萄糖耗尽后逐渐成为限制因素，从而避免在早期形成纯PHB“核心块”，促进生成更均一的“随机型”PHBVV三元聚合物。

**3.3.1 Biomass Growth Phase Evaluation**

实验表明，葡萄糖阶段最大比生长速率为0.14 ± 0.01 h^?1，比葡萄糖摄取速率为0.27 ± 0.02 g_Gluc g_X^?1 h^?1。约30 h葡萄糖耗尽，pO₂升高并触发首次LA脉冲补料，此时体系中残余NH₄⁺约0.8 g L^?1，与培养基设计预期相符，并足以抑制过早PHA积累。此阶段PHA含量低于1 g L^?1，仅约占生物量10%，说明葡萄糖阶段未发生显著聚合物合成。补加LA后，OUR与CER在1 h内回升，证明细胞迅速完成底物适应，并利用残余氮源继续增殖。氨完全耗尽发生于44 h，标志着增长阶段结束。产率分析显示，葡萄糖生物量产率为0.39 ± 0.02 g_X g_Gluc^?1，LA生物量产率为0.29 ± 0.01 g_X g_LA^?1，氮源生物量产率为5.8 ± 0.9 g_X g_NH4+^?1。这些数据构成了后续放大比较的重要基线。

**3.3.2 PHBVV Production Phase**

当NH₄⁺完全耗尽后，PHA积累迅速增强，Q_PHA明显上升，STY在48 h达到峰值并在55 h前保持稳定，之后因细胞逐步被PHA“填满”而下降。值得注意的是，LA消耗峰值早于氮耗尽，提示在中间阶段LA同时用于生长与PHA合成，这与高C/N即可启动PHA合成的认识一致。最终，7.5 L规模获得最大生物量40.2 ± 0.9 g L^?1，PHA含量75% ± 9% CDW，PHA对LA产率0.32 ± 0.02 g_PHA g_LA^?1。聚合物组成为60% ± 3% 3HB、38% ± 2% 3HV和2% ± 1% 4HV，证明所建工艺能够稳定获得高3HV含量PHBVV。

**3.4 Process Transfer to the Technical Scale**

在42 L技术规模中，研究人员采用基于单位体积总比功率输入P_t的搅拌放大策略，并结合kL a与混合时间t_m进行校正。该方法兼顾供氧、混合和剪切风险，是作者选择的放大折中准则。通过计算得到42 L初始与最大转速估计值，并与实际运行结果较好吻合，说明P_t可作为该工艺放大的可行核心参数。作者还依据混合时间成比例放大脉冲补料持续时间，并加入1.2安全系数，以降低局部底物浓度梯度风险。

**3.4.2 Evaluation of 42-L Scale PHA Production**

42 L体系中，葡萄糖阶段最大比生长速率降至0.11 ± 0.01 h^?1，显著低于7.5 L，葡萄糖耗尽时间也推迟至约37 h；但比葡萄糖摄取速率与实验室规模无显著差异。作者据此认为，技术规模初期生长受抑并非摄糖能力下降，更可能与较高氧分压或功率在较少搅拌层级上的分布差异有关。进入LA阶段后，LA生物量产率为0.39 ± 0.06 g_X g_LA^?1，高于实验室规模；LA上的比生长速率也升高至0.10 ± 0.02 h^?1，但统计学上未证实显著。51 h氮源耗尽后进入PHA生产阶段，其变化趋势与小试基本一致。最终获得最大生物量33 ± 1 g L^?1，PHA含量76% ± 2% CDW，PHA对LA产率0.34 ± 0.02 g_PHA g_LA^?1。生成的PHBVV单体摩尔组成为52:46:2（3HB:3HV:4HV）。尽管最终生物量略低于7.5 L，PHA含量与产率高度可比，说明工艺放大总体成功。

作者进一步将结果与文献比较，指出本研究在以LA为主要生产底物条件下获得了较高生物量和较高PHA含量，优于部分既有报道。关于两尺度间3HV比例由38%升至46%的现象，文中仅谨慎指出其可能与技术规模中轻微LA积累或较高气相压力下CO₂溶解度增加导致的细胞应激有关，但并未将其作为确定结论，而是建议未来研究进一步验证相关联系。

**3.5 Evaluation of pH- and pO₂-Dependent Feeding Strategy**

研究结果表明，pH-pO₂耦合补料在7.5 L和42 L上均能有效响应底物需求：当pO₂升高时，系统触发Feed 1；当细胞消耗LA导致培养液pH变化时，系统通过Feed 2补充LA并稳定pH。该策略在高代谢活性阶段能够很好地避免底物积累和抑制。然而，在PHA后期积累过程中，随着细胞代谢活性下降、OUR和CER降低，即便体系仍有残余LA，pO₂也会因供氧相对过剩而逐渐上升，从而产生“假性底物耗尽”信号并误触发Feed 1，造成LA轻微累积。这一现象揭示了单独依赖pO₂作为晚期补料判据的局限性，也为后续将CER引入双参数控制或在后期切换回双侧搅拌控制提供了依据。

讨论部分的核心在于，作者并未将该研究仅停留于“可生产”的证明，而是通过系统生理参数表征，揭示了进一步优化的方向。其一，技术规模葡萄糖阶段比生长速率下降提示降低氧化应激可能有助于恢复小试生长性能；其二，LA阶段相近的生物量与产物产率说明轻度LA积累并未显著损害过程表现，但若要增强稳健性，仍需通过呼吸信号识别底物耗尽与PHA饱和两种不同状态；其三，P_t主导、兼顾kL a和t_m的放大路径证明该工艺具备较好转移性，为其他有机酸底物和更大规模反应器提供了方法学参考。

研究结论可译述为：Cupriavidus necator NCIMB 11599适合以LA为主要底物生产PHBVV。通过建立包含反馈回路的专用控制程序，研究人员成功避免了饥饿阶段，尤其是单侧与双侧搅拌控制之间的切换，在工艺由7.5 L向42 L系统转移过程中展现出重要价值，可在无需重新整定控制参数的情况下实现可靠且无延迟的补料启动。通过耦合pO₂与pH信号，营养供给得以按需自动化，从而在两个尺度上有效控制LA补加并减轻底物抑制。尽管单侧搅拌控制与后期代谢活性下降会导致误触发和少量LA积累，但通过整合CER信号或引入自适应pO₂阈值，有望进一步提高大规模运行稳健性。总体而言，该研究建立了一种可放大、可自动化且能实现高HV掺入的PHBVV发酵策略，为面向高细胞密度和工业可行性的PHA生物工艺优化提供了方法学框架，并为解析影响聚合物产量与质量的因素提供了清晰路径。