整合组学分析揭示类黄酮介导的番茄番茄斑萎病毒抗性机制

《Food and Energy Security》：Integrated Omics Analysis Reveals Flavonoid-Mediated Resistance to Tomato Spotted Wilt Virus

　　

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）对全球番茄生产构成严重威胁。培育抗病品种需要深入了解植物–病毒互作的分子机制。本研究采用整合转录组（transcriptomic）与代谢组（metabolomic）分析方法，比较接种TSWV后3天（3 days post-inoculation，3 dpi）中抗番茄品系MR2T826与两个感病品系SV2T482和SV2T1130的防御响应。代谢组鉴定出共计1970种代谢物，其中类黄酮（flavonoids）与生物碱（alkaloids）为最丰富类别。基于KEGG的通路分析显示，在两个比较组（MR2T826_vs_SV2T482和MR2T826_vs_SV2T1130）中富集显著性排名前四的通路为：茄啶碱与澳洲茄碱甾体糖基生物碱生物合成（Biosynthesis of solanidine and solasodine steroidal glycoalkaloids）、类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）、黄酮与黄酮醇生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）及槲皮素苷元Ⅰ生物合成（Biosynthesis of quercetin aglycones I）。对类黄酮生物合成通路的进一步分析鉴定出18个共有类黄酮差异积累代谢物（differentially accumulated metabolites，DAMs），其中11个在MR2T826中一致上调，包括数种类槲皮素衍生物。同时，转录组分析发现两比较组中共有450个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），其中180个在MR2T826显著上调，包括关键转录因子（如NAC22、NAC56、BH063）及病程相关蛋白基因。整合KEGG分析显示，与感病品系相比，抗用品系MR2T826中槲皮素相关代谢物与类黄酮生物合成关键基因协同上调，表明类黄酮相关通路被增强激活。综上，研究结果表明类黄酮生物合成的激活——可能由特定转录因子协调并伴随抗氧化能力提升——与番茄对TSWV的抗性响应相关。这些发现为中抗番茄品系的代谢特征提供了新认识，并为后续功能研究与抗病育种提供了潜在靶标。

论文解读：整合组学分析揭示类黄酮介导的番茄番茄斑萎病毒（TSWV）抗性机制

该研究发表于《Food and Energy Security》。番茄（Solanum lycopersicum L.）是全球重要蔬菜作物，而由西花蓟马传播的番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）可感染千余种植物，引起植株矮化、萎蔫、坏死或褪绿环斑，造成严重产量与品质损失。目前生产中主要依赖显性Sw-5系列主效抗病基因，但已出现打破该抗性的TSWV分离物，单一基因免疫存在脆弱性。植物抗病是由生理变化及基因表达与代谢广泛重编程构成的复杂网络，植物次生代谢物（如类黄酮flavonoids）因结构多样性和潜在抗病毒活性成为研究热点，但番茄–TSWV互作中特定代谢特征与调控机制尚不完全清楚。为明确中抗番茄品系对TSWV的响应机制，研究人员利用田间筛选出的中抗品系MR2T826与两个感病品系SV2T482、SV2T1130，于接种TSWV后3天开展整合转录组与广靶代谢组分析，探究与抗性关联的代谢物及基因表达变化，为番茄TSWV抗性育种及环保抗病毒制剂开发提供理论依据与候选靶点。

主要关键技术方法：研究人员选用经田间评价具中抗性的番茄品系MR2T826及感病种质SV2T482、SV2T1130为供试材料，TSWV人工摩擦接种后3天取系统叶，分别进行广靶代谢组检测（UPLC-ESI-MS/MS，差异积累代谢物DAMs筛选标准为VIP≥1且|log₂FC|≥1，KEGG注释与富集）及转录组测序（RNA-seq，比对番茄参考基因组SL3.0，差异表达基因DEGs筛选标准为|log₂FC|≥1且FDR＜0.05，KEGG富集），并对共有DAMs与DEGs开展KEGG通路共富集分析，选取类黄酮生物合成关键基因以RT-qPCR验证转录组结果；另测定3 dpi抗氧化酶（SOD、CAT、POD）含量，28 dpi观测表型、株高及TSWV N基因拷贝数。

3 Results（结果）

3.1 Analysis of Phenotypes and Viral Accumulation of Moderately Resistant and Susceptible Tomato Lines After TSWV Inoculation（TSWV接种后中抗与感病番茄品系表型及病毒积累分析）

接种后28天（28 dpi），中抗品系MR2T826生长正常无可见叶部症状，株高显著更高（82.67 cm），感病品系SV2T482出现大面积褪绿斑、SV2T1130有轻微褪绿伴叶柄叶脉紫化且株高较低（58.0 cm与59.6 cm）；RT-qPCR定量TSWV N基因拷贝数证实MR2T826病毒积累显著低于两感病品系。结论：中抗品系MR2T826可有效抑制TSWV复制并保持较优生长态势。

3.2 Antioxidant Enzyme Content Assay（抗氧化酶含量测定）

3 dpi时，MR2T826超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性（923.4 ng/g FW）显著低于两感病品系（分别为1236.3与1483.0 ng/g FW），过氧化氢酶（catalase，CAT）活性无显著差异，而过氧化物酶（peroxidase，POD）活性（2.79 ng/g FW）显著高于SV2T482（1.50 ng/g FW）与SV2T1130（2.10 ng/g FW）。结论：MR2T826对TSWV的抗性可能与POD活性升高有关。

3.3 Metabolites Analysis Among Tomato Lines After TSWV Inoculation（TSWV接种后番茄品系间代谢物分析）

广靶代谢组共鉴定1970种代谢物，生物碱（15.94%）与类黄酮（14.42%）占比最高；主成分分析（principal component analysis，PCA）显示三组代谢谱明显分离。MR2T826 vs. SV2T482和MR2T826 vs. SV2T1130分别筛选出182和211个差异积累代谢物（DAMs），类黄酮均为最主要类别之一；KEGG富集前两比较组均显著富集甾体糖基生物碱生物合成、类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）、黄酮与黄酮醇生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）及槲皮素苷元Ⅰ生物合成。两比较组共有74个DAMs，其中18个为类黄酮，11个在MR2T826一致上调（含新橙皮苷、圣草次苷Eriodictyol-7-O-rutinoside即eriocitrin、槲皮素-3-O-(6″-O-丙二酰)葡萄糖苷等槲皮素衍生物）。结论：中抗品系MR2T826发生类黄酮相关代谢重编程，槲皮素衍生物协同上调可能与抗性相关。

3.4 Transcriptome Analysis of Moderate Resistant and Susceptible Tomato Lines After TSWV Inoculation（TSWV接种后中抗与感病番茄品系转录组分析）

转录组质控合格，比对率＞95%；PCA显示三组分离明显。MR2T826 vs. SV2T1130和vs. SV2T482分别得到1134和1086个差异表达基因（DEGs），其中450个为共有DEGs，180个在MR2T826显著上调。上调基因中含转录因子NAC22（NAC domain-containing protein 21/22）、NAC56（NAC transcription factor 56）、BH063（转录因子bHLH63）、BZP53（bZIP transcription factor 53），以及NB-LRR类抗病基因R1C3（putative late blight resistance protein homology R1C-3）和病程相关蛋白基因PR6（pathogenesis-related leaf protein 6）、PR4、PR2。GO富集显示上调基因参与细胞过程、代谢过程及对刺激响应等生物学过程。结论：中抗品系中存在协同转录调控网络，涉及调控类黄酮合成及防卫反应的转录因子与PR基因。

3.5 Combined Analysis of Metabolome and Transcriptome（代谢组与转录组联合分析）

KEGG共富集显示转录组信号强于代谢组，"代谢途径"与"次生代谢物生物合成"在转录水平显著富集；代谢组在MR2T826 vs. SV2T1130比较中黄酮与黄酮醇生物合成通路富集相对明显。类黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）及黄酮与黄酮醇生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）通路在两层组学中均被检出。聚焦上述通路发现MR2T826中槲皮素（Quercitrin）、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰-β-D-葡萄糖苷)（Quercetin 3-O-(6-O-malonyl-beta-D-glucoside)）、槲皮素-3-O-桑布双糖苷（Quercetin-3-O-sambubioside）含量显著升高，且类黄酮关键合成基因查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）、花青素合酶（anthocyanidin synthase，ANS）、黄酮醇合酶（flavonol synthase，FLS）、类黄酮3′,5′-羟化酶（flavonoid 3′,5′-hydroxylase，F3′5′H）及黄酮类3′-单加氧酶（flavonoid 3′-monooxygenase，CYP75B1）表达亦显著上调。结论：中抗品系中槲皮素相关代谢物积累与类黄酮生物合成关键基因上调呈协调对应关系。

3.6 Verification of Genes Related to Flavonoid Biosynthesis by qPCR（类黄酮生物合成相关基因的qPCR验证）

RT-qPCR结果显示F3′5′H（Solyc08g079317.1）、CYP75B1（Solyc08g079310.3）、FLS（Solyc06g068260.2）、黄酮醇-3-O-葡萄糖苷L-鼠李糖基转移酶FG2（flavonol-3-O-glucoside L-rhamnosyltransferase，FG2，Solyc02g070020.1）在MR2T826中相对表达高于感病品系，且F3′5′H、FLS、FG2表达趋势与RNA-seq的FPKM值一致。结论：转录组测序所得类黄酮通路基因表达变化可靠。

讨论与结论总结

讨论指出，中抗品系MR2T826中类黄酮代谢（尤槲皮素衍生物）与相关合成基因（CHI、FLS、F3′5′H、CYP75B1）协同上调是抗性关联的突出特征；槲皮素具较强抗氧化及报道的抗病毒活性，但其作用具情境依赖性。共有450个DEGs中含NAC、bHLH、bZIP家族转录因子，提示存在协调转录网络调控防卫与次生代谢，需功能验证其是否直接调控类黄酮合成。抗氧化方面，MR2T826呈现POD活性升高伴SOD活性降低的选择性氧化还原调节策略，与类黄酮协同可能构成抗氧化防御体系以控ROS（reactive oxygen species，活性氧）平衡并限制病毒复制。研究局限包括基于关联组学、单时间点（3 dpi）及遗传背景差异，未来需时间序列、基因敲除/过表达等功能实验佐证。

结论（Conclusions）翻译：综上所述，整合转录组与代谢组分析揭示了与TSWV抗性相关的协调变化，类黄酮相关通路在两套组学中均被一致识别。尽管这些发现突出了类黄酮代谢在抗性响应中的潜在作用，所观察到的关联仍为相关性，需进一步功能验证。总体而言，本研究为理解植物抗病毒响应提供了多组学框架，并为未来研究指明了候选通路。