Bepirovirsen通过TLR8信号通路潜在诱导肝脏固有免疫活化的研究

《JHEP Reports》：Bepirovirsen induces innate immune activation in the liver potentially through TLR8 signaling

　　

背景与目的：Bepirovirsen是一种处于慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B virus, HBV感染)Ⅲ期临床试验阶段的未偶联反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASO)。一项Ⅱa期研究的事后分析显示，给予bepirovirsen后立即产生细胞因子，由此推测bepirovirsen除在肝细胞中已知的直接抗病毒机制外，还可能通过肝非实质细胞中的模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)发挥固有免疫刺激活性。方法：采用Myriad RBM、Olink或MSD(meso scale discovery)检测Ⅱa期研究血清和血浆样本的细胞因子；使用健康供者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC；流式细胞术、MSD)及过表达PRR的HEK(human embryonic kidney)细胞或THP-1细胞评估bepirovirsen诱导的固有免疫活化；采用野生型(wild-type, WT)及hTLR8(transgenic human TLR8)转基因小鼠，以Luminex或MSD检测血浆细胞因子蛋白水平，以RT?qPCR及RNAscope检测体内基因表达(仅于hTLR8转基因小鼠进行)。结果：Bepirovirsen治疗的慢性HBV受试者中多种促炎细胞因子(参与免疫细胞招募与活化)上调；健康供者PBMC体外经bepirovirsen处理后得到相似结果；对过表达PRR细胞的固有免疫活化分析显示，仅当存在人TLR8(human Toll-like receptor 8, hTLR8)时才有微弱但阳性(p＝0.00085)的诱导；hTLR8转基因小鼠(而非WT小鼠)经bepirovirsen处理可诱导促炎细胞因子，与TLR8激动剂selgantolimod相似；肝库普弗细胞(Kupffer cell)及巨噬细胞被鉴定为hTLR8小鼠肝脏中对bepirovirsen的主要应答细胞。结论：临床与前临床数据显示bepirovirsen引发固有免疫应答(表现为炎症细胞因子诱导)，该效应至少部分由TLR8激动介导，与其已确立的抗病毒机制互为补充。影响与意义：本研究旨在基于bepirovirsen可在肝非实质细胞通过PRR引发固有免疫应答的假设，阐明其额外作用机制。Ⅱa期样本显示bepirovirsen诱导IFN?γ、TNF及其他细胞因子；体外证明bepirovirsen具有固有免疫刺激活性，可能通过人TLR8介导；且bepirovirsen诱导的固有免疫活化不同于其他ASO。研究表明bepirovirsen除已知抗病毒机制外可经TLR8激动诱导固有免疫应答，但该免疫调节效应的临床意义尚不清楚，需进一步研究。

本文解读GSK疫苗与感染性疾病研究单元发表于《JHEP Reports》的研究"Bepirovirsen induces innate immune activation in the liver potentially through TLR8 signaling"。慢性乙型肝炎病毒(chronic Hepatitis B Virus, cHBV)感染全球约影响2.54亿人，其功能治愈需同时抑制HBV DNA/抗原并恢复HBV特异性免疫。Bepirovirsen是一款靶向HBV mRNA降解的2′-O-甲氧基乙基(2′-O-methoxyethyl, 2′-MOE) Gapmer设计未偶联反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASO)，在Ⅱa期(NCT02981602)试验中表现出HBsAg降低及伴发的ALT升高，提示可能存在除直接抗病毒外的免疫激活机制。由于未偶联ASO可更广泛分布于肝非实质细胞(non-parenchymal cells, NPCs；如库普弗细胞/Kupffer cells、肝巨噬细胞)，而此类细胞高表达模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)如TLR8，研究人员假设bepirovirsen可通过PRR介导固有免疫激活，故开展本研究验证此假说。

研究人员采用的关键技术方法如下：①Ⅱa期临床样本(NA初治及NA经治慢乙肝受试者，bepirovirsen 150 mg/300 mg或安慰剂，多时点采血)以Olink蛋白质组panel、Myriad RBM multiplex immunoassay及Quanterix SIMOA检测血浆/血清细胞因子及HBsAg、ALT；②健康供者外周血单个核细胞(peripheral blood monuclear cell, PBMC)体外刺激，以MSD检测上清细胞因子，25色流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测免疫细胞亚群(单核细胞、树突状细胞dendritic cell, DC、NK细胞等)胞内细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、CXCL10)及活化标志物(CD40、CD86、CD163)；③PRR过表达HEK-Blue?细胞系(TLR2/3/4/5/7/8/9、RIG-I、MDA5、STING、mTLR8)转染bepirovirsen后以NF-κB/IRF报告基因读数筛选应答PRR；④野生型(wild-type, WT)C57BL/6及人TLR8(hTLR8)敲入转基因小鼠皮下注射bepirovirsen、TLR8激动剂selgantolimod、对照ASO(GalNAc偶联GSK3389404及其他2′-MOE Gapmer ASO)，4 h采血以Luminex/MSD测血浆细胞因子，取肝/回肠/脾以RT-qPCR测Il12b、Tnf等基因表达，以RNAscope多重荧光原位杂交(in situ hybridization, ISH)联合F4/80免疫组化(immunohistochemistry, IHC)定位肝内细胞因子mRNA阳性细胞。

研究结果如下：

急性反应包括细胞外基质维护标志物和炎症应答通路：Ⅱa期NA初治受试者接受bepirovirsen 300 mg后≤6 h血浆Olink 1536 Explore检测显示胶原IVα1(COL4A1)、骨桥蛋白(SPP1)、SPARC及淀粉样前体样蛋白1(APLP1)等细胞外基质维护标志物上调，趋化因子CCL20、CCL25及血管生成素1(ANGPT1)显著升高(p<0.05 vs基线)；24 h时IFN-γ、TNF、CCL2、CCL4、CSF1/3、IL-12B、CCL19等促炎/趋化因子上调，部分与经典TLR8信号分子(IFN-γ、TNF、CCL2/4、IL-12p35/p40)重叠；超敏SIMOA未检出Ⅰ型IFN(IFN-α/β)，部分受试者可检出IFN-γ升高。结论：bepirovirsen给药后早期即诱导与TLR8特征相符的炎症及趋化因子谱。

纵向免疫介质升高与ALT升高及HBsAg下降相关：纵向血清Olink Target 96 Inflammation panel显示，bepirovirsen治疗者(含NA经治)多种细胞因子/趋化因子较安慰剂上调；将 analyte 与ALT(r>0.6)或HBsAg(r>0.6，负相关)做Pearson相关，发现CXCL9/11(IFN-γ信号)、TNFRSF9(4-1BB，免疫活化)等与ALT峰值或HBsAg降幅同步变化；按Day 29 HBsAg降幅分层，应答者(>1.9 log₁₀降幅)IFN-γ通路及T细胞应答通路细胞因子增幅高于无应答者(<0.2 log₁₀降幅)。结论：bepirovirsen抗病毒疗效(HBsAg降低)伴随更强的固有/适应性免疫介质诱导。

Bepirovirsen体外通过单核细胞、DC及NK细胞诱导人PBMC固有免疫活化：健康供者PBMC以近似肝预测暴露浓度bepirovirsen孵育18 h，MSD检测上清显示IFN-γ、IL-6、CXCL10、TNF-α、IL-12p40显著诱导(p≤0.0001)，IL-18弱诱导(p=0.0263)，IL-1β无变化，Ⅰ型IFN未检出，与临床谱一致；流式显示单核细胞(CD14⁺⁺CD16^?等)产IL-12p40、CXCL10、IFN-γ、TNF-α及颗粒酶B(granzyme B, GZMB)，CD1c⁺CD11b⁺DC产IL-12p40及IFN-γ，NK细胞(CD16⁺CD56^dim)部分产IFN-γ及GZMB，T/B细胞无明显应答；单核细胞CD40/CD86/CD163及DC CD86上调。结论：bepirovirsen体外主要活化髓样及部分淋巴样先天免疫细胞，符合肝NPC中库普弗细胞/巨噬细胞为主要靶细胞推论。

Bepirovirsen弱诱导人TLR8过表达细胞活化：转染bepirovirsen至各PRR过表达HEK细胞，仅hTLR8过表达细胞NF-κB报告基因呈弱但显著激活(fold change≈1.7 vs DOTAP对照，p=0.00085)，鼠TLR8(mTLR8)、TLR2/3/4/5/7/9、RIG-I、MDA5、STING均无响应；空载体/null细胞无响应。结论：bepirovirsen对hTLR8具特异性弱激动活性，提示其固有免疫活化可能经hTLR8介导。

Bepirovirsen在hTLR8转基因小鼠模型中通过hTLR8诱导细胞因子：WT小鼠皮下bepirovirsen/selgantolimod/对照ASO均未见明显血浆细胞因子升高；hTLR8小鼠bepirovirsen及selgantolimod显著升高血浆IL-12p40、TNF-α(p<0.001 vs vehicle)、IL-6等，对照ASO 141923(同长度2′-MOE Gapmer不同序列)及GalNAc偶联GSK3389404仅微弱或无诱导；RT-qPCR显示hTLR8小鼠肝组织Il12b(p40编码基因)、Tnf mRNA显著上调(p<0.0001 vs vehicle)，回肠selgantolimod强诱导而bepirovirsen较弱，脾脏均弱；AAV-HBV感染不影响该诱导。结论：bepirovirsen在体激活hTLR8依赖性肝脏固有免疫，具序列/结构特异性，不同于TLR9激活ASO。

Bepirovirsen体内诱导的固有免疫活化谱不同于所测其他ASO：hTLR8及WT小鼠分别给予bepirovirsen、selgantolimod、含CpG基序TLR9激活ASO(421856)、低炎性ASO(104838)及其他Gapmer(141923)；TLR9激活ASO在WT及hTLR8小鼠均诱导细胞因子，bepirovirsen仅在hTLR8小鼠诱导TNF-α、IL-6、IL-12p40且幅度高于其他测试ASO(p<0.05~0.0001)。结论：bepirovirsen的hTLR8依赖性免疫活化是其独特性质，非所有2′-MOE Gapmer共有。

库普弗细胞及巨噬细胞是肝脏中对bepirovirsen的主要应答细胞：hTLR8小鼠给药4 h后肝组织RT-qPCR示Tnf、Ccl2、Ccl4、Cxcl10显著诱导；RNAscope ISH联合F4/80 IHC显示Ccl2、Ccl4、Tnf mRNA主要定位于F4/80⁺库普弗细胞/巨噬细胞(p<0.05 vs vehicle及vs F4/80^?肝细胞)，Cxcl10在F4/80⁺及F4/80^?(肝细胞)均有表达，提示后者可能为TNF-α等旁分泌次级诱导。结论：肝固有免疫应答主要由表达hTLR8的库普弗细胞/肝巨噬细胞直接介导。

讨论与结论翻译：基于临床观察，研究人员假设bepirovirsen在已知抗病毒机制外可引发固有免疫应答。Ⅱa期样本分析提示bepirovirsen治疗后诱导Ⅱ型IFN(IFN-γ)而Ⅰ型IFN多未检出，IFN-γ、TNF及其他细胞因子诱导及有限IFN-α检出符合TLR8激动剂特征及selgantolimod临床细胞因子谱。通过体外及体内前临床系统，研究人员证实bepirovirsen具固有免疫刺激活性，可能经人TLR8介导；PRR过表达筛选仅hTLR8弱响应，hTLR8转基因小鼠(非WT)出现细胞因子升高且不同于TLR9激活ASO；PBMC中单核细胞、DC及NK细胞为主要应答细胞；hTLR8小鼠肝内细胞因子基因主要在库普弗细胞/F4/80⁺巨噬细胞表达，Cxcl10部分由肝细胞经旁分泌次级诱导。以往认为bepirovirsen可能经TLR9起作用，但本研究未见典型TLR9特征(如IFN-α诱导、WT小鼠响应、CpG基序)，且与其他TLR9激活ASO免疫谱不同，支持其通过hTLR8非TLR9途径。结论：体内外研究表明bepirovirsen除已证实的抗病毒机制外，可通过诱导细胞因子引发固有免疫应答，至少部分由TLR8激动介导，这可能有助于其临床抗HBV疗效，但该免疫调节作用的临床意义尚需进一步研究明确。