编码TgGRA47和TgGRA72的DNA疫苗在BALB/c小鼠中诱导抗弓形虫感染的保护性免疫

《Transboundary and Emerging Diseases》：Protective Immunity Induced by DNA Vaccines Encoding TgGRA47 and TgGRA72 Against Toxoplasma gondii Infection in BALB/c Mice

　　

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种细胞内寄生的原虫，可引起绝大多数恒温脊椎动物（如人类）的人畜共患病。尽管TgGRA47和TgGRA72在决定弓形虫生长和毒力方面具有重要的生物学作用，但尚未有研究聚焦于这两种致密颗粒蛋白（dense granule proteins, GRAs）能否作为抗弓形虫感染的DNA疫苗候选分子。为探讨该问题，研究人员评估了DNA疫苗pVAX-GRA47和pVAX-GRA72在弓形虫PRU株感染BALB/c小鼠中的免疫保护效果。研究结果表明，TgGRA47和TgGRA72是潜在的DNA疫苗候选分子，能够在小鼠模型中产生强烈的体液免疫以及Th1型和Th17型偏倚的细胞保护性免疫，以对抗弓形虫病。

弓形虫病是由弓形虫引起的一种重要人畜共患病，可感染包括人类在内的绝大多数恒温脊椎动物。在免疫正常的宿主中，弓形虫感染通常无明显临床症状，但在免疫抑制宿主（如器官移植、肿瘤或艾滋病患者）中可导致严重的弓形虫病。此外，孕妇感染可造成胎儿先天性感染。在动物中，弓形虫感染可导致猪和羊的新生仔畜死亡、死胎和流产，造成严重的经济损失和公共卫生挑战。目前，化学药物如乙胺嘧啶和磺胺嘧啶虽可用于治疗急性弓形虫感染，但无法清除组织包囊，且存在药物残留和耐药性等问题。免疫预防被认为是预防弓形虫感染的可行途径，但唯一的商业化疫苗——基于速殖子S48减毒株的活疫苗（Toxovax）仅限于预防羊的流产，且因存在毒力返祖风险而无法用于人类。因此，开发有效、安全的弓形虫疫苗至关重要。

DNA疫苗因其安全性、便捷性、经济性以及诱导强效抗体介导和细胞介导免疫应答的能力，近年来受到广泛关注。弓形虫的多种抗原成分，包括致密颗粒蛋白（GRAs）、微线体蛋白（microneme proteins, MICs）、棒状体蛋白（rhoptry proteins, ROPs）和表面抗原（surface antigens, SAGs）等，已被探索作为DNA疫苗候选分子。其中，GRAs在入侵、寄生泡形成、宿主细胞操纵和免疫逃逸中发挥关键作用。TgGRA47和TgGRA72是近年来新发现的致密颗粒蛋白，主要参与调控寄生泡膜的小分子通透性；TgGRA47还被证实对弓形虫增殖以及急性和慢性毒力具有重要作用。鉴于这两种蛋白在弓形虫生长和毒力决定中的关键作用，研究人员推测其可能作为DNA疫苗候选分子，但此前尚无相关研究。为此，研究人员构建了真核表达质粒pVAX-GRA47和pVAX-GRA72，旨在评估这两种DNA疫苗诱导的免疫应答效能及其对急性和慢性弓形虫感染的保护潜力，相关成果发表于《Transboundary and Emerging Diseases》。

该研究涉及的主要技术方法包括：首先通过生物信息学分析（PROTEAN模块）预测TgGRA47和TgGRA72的抗原性；将编码序列克隆至pVAX I-HA载体构建DNA疫苗，并在HEK 293-T细胞中通过间接免疫荧光和Western blot验证重组蛋白表达；选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行DNA免疫（每两周一次、共三次肌肉注射），设立pVAX-GRA47单基因、pVAX-GRA72单基因、pVAX-GRA47+pVAX-GRA72联合免疫组及pVAX I空载体、PBS、空白对照组；通过ELISA检测血清IgG及其亚型；MTT法检测脾淋巴细胞增殖；流式细胞术分析CD4⁺、CD8⁺ T细胞比例及树突状细胞（DCs）表面标志物（CD83、CD86、MHC-I、MHC-II）；ELISA检测细胞因子（Th1型：IFN-γ、IL-2、IL-12p40、IL-12p70；Th2型：IL-4、IL-10；Th17型：IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23）；乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性；攻毒实验分别采用100个PRU株包囊（致死剂量）评估生存时间、20个包囊（非致死剂量）评估脑组织包囊负荷。

**生物信息学分析及重组质粒的体外鉴定**：生物信息学分析显示，TgGRA47和TgGRA72均含有多个抗原指数高、亲水性强、表面可及性高的区域，且对应于灵活的蛋白质结构域，提示其具有良好的B细胞表位和免疫原性。间接免疫荧光（IFA）显示，转染pVAX-GRA47或pVAX-GRA72的HEK 293-T细胞中可见特异性绿色荧光，而空载体对照组无荧光；DAPI复染确认蛋白的细胞定位。Western blot进一步证实转染组出现对应于TgGRA47和TgGRA72的特异性条带，而空载体组无条带，表明重组质粒可在真核细胞中成功表达。

**体液免疫**：ELISA检测显示，所有免疫组小鼠的抗弓形虫IgG抗体水平均显著高于三个对照组（p < 0.001），且联合免疫组诱导的IgG水平最高，显著高于两个单基因免疫组（p < 0.001）；两个单基因组间无显著差异（p > 0.05）。IgG水平随免疫次数增加而逐渐升高，于末次免疫后6周达峰值。IgG亚型分析显示，联合免疫组的IgG1、IgG2a水平及IgG2a/IgG1比值均最高，单基因免疫组居中，提示DNA疫苗诱导了Th1型偏倚的体液免疫应答。

**细胞因子产生**：脾淋巴细胞经弓形虫裂解抗原（TLA）刺激后，联合免疫组产生的Th1相关细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-12p40、IL-12p70）和Th17相关细胞因子（IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23）水平均显著高于两个单基因免疫组（p < 0.001），而单基因组间无显著差异（p > 0.05）。同时，Th2型细胞因子IL-4和IL-10在联合免疫组中也显著上调，但对照组间无显著差异。

**T细胞应答及DC活化**：MTT法检测显示，所有免疫组的脾淋巴细胞刺激指数（SI）均高于对照组，联合免疫组最高。流式细胞术分析显示，联合免疫组CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞比例显著高于单基因免疫组（p < 0.001）。DC表面标志物分析表明，联合免疫组CD83、CD86、MHC-I和MHC-II的表达水平均显著高于单基因免疫组（p < 0.001），提示DC成熟和活化增强。CTL活性检测显示，各免疫组的CTL活性随效靶比升高而增强，联合免疫组在效靶比80:1时活性最高，显著高于单基因免疫组（p < 0.001）。

**抗弓形虫保护效果**：致死攻击实验（100个PRU株包囊）显示，所有免疫组小鼠的生存时间均显著延长，而对照组小鼠均在感染后23天内死亡；联合免疫组的生存时间显著长于单基因免疫组（p < 0.01）。慢性感染模型（20个包囊）显示，免疫组脑组织包囊数均显著低于对照组（p < 0.001），pVAX-GRA47和pVAX-GRA72单基因组的减囊率分别为37.6%和38.3%（组间无显著差异），联合免疫组的减囊率达53.2%，显著高于两个单基因免疫组（p < 0.001）。

**讨论部分总结**：研究人员指出，DNA疫苗作为预防细菌、病毒及寄生虫感染的有前景策略，具有成本低、易生产、可诱导持久体液和细胞免疫应答等优势。尽管多种弓形虫抗原已被探索为DNA疫苗候选分子，但尚无候选分子能在小鼠模型中诱导 sterilizing immunity（完全阻断感染）。此前GRA15、GRA16、GRA24和GRA25等致密颗粒蛋白已被证实可提供一定程度的保护，本研究首次评估了TgGRA47和TgGRA72的疫苗潜力。

研究证实，pVAX-GRA47和pVAX-GRA72单独或联合免疫均可诱导Th1/Th17型细胞免疫应答，联合免疫效果优于单基因免疫，这与多抗原DNA疫苗可增强免疫保护的研究结论一致。抗体介导的体液免疫在抗弓形虫感染中具有重要作用，特异性抗体可通过中和寄生虫黏附或激活补体经典途径发挥效应。IgG2a与Th1应答相关，IgG1与Th2应答相关，本研究中IgG2a/IgG1比值升高提示Th1型免疫偏倚。

DC作为专业抗原呈递细胞，其表面CD83、CD86、MHC-I和MHC-II的表达上调是成熟和活化的标志，有助于向CD4⁺和CD8⁺ T细胞呈递抗原，进而激活T细胞应答。然而，研究人员也指出，这些标志物的上调虽提示DC成熟增强，但尚需功能学实验进一步验证其抗原呈递效率。

Th1型免疫（IFN-γ、IL-2、IL-12）是清除细胞内寄生虫所必需的，其中IFN-γ是最重要的细胞因子，可诱导炎症反应促进速殖子清除；IL-2调节细胞毒性T细胞的增殖和功能；IL-12则诱导Th1细胞分化和IFN-γ产生。同时，Th2型细胞因子IL-4和IL-10的共存可调节过度的Th1反应，维持免疫平衡，避免免疫病理损伤。

Th17细胞在抗细胞内寄生虫感染中的作用日益受到关注。本研究中IL-17A、IL-17F、IL-22和IL-23的显著上调表明Th17通路被激活，这可能促进早期先天免疫应答，限制寄生虫播散。Th1和Th17应答的协同诱导为疫苗保护效果提供了免疫学解释。

T细胞介导的适应性免疫对控制急性感染和慢性感染再活化至关重要。CD8⁺ T细胞在急性期限制速殖子扩散，慢性期参与脑包囊的裂解；CTL活性是控制细胞内弓形虫复制的关键。本研究中脾淋巴细胞增殖、CD4⁺/CD8⁺ T细胞比例升高及CTL活性增强，均表明DNA疫苗诱导了弓形虫特异性T细胞应答。

研究人员选用PRU株（II型）而非高毒力的RH株（I型）进行攻毒实验，因为II型是引起人类弓形体病的主要基因型，且100个包囊的口服攻击更适合观察免疫后的生存时间。研究结果表明，该DNA免疫仅诱导了部分保护效果，小鼠最终仍死亡或出现临床症状，提示未来研究应考虑联合分子佐剂以增强保护效果，并需进一步评估重组DNA质粒的长期稳定性和安全性。

**研究结论翻译**：总之，研究人员证明了编码TgGRA47和/或TgGRA72的DNA疫苗是潜在的疫苗候选分子，其可激活抗体介导的免疫以及Th1型和Th17型偏倚的应答，在实验小鼠中产生针对弓形虫病的强保护性免疫应答。这些发现可能有助于研发更有效的靶向弓形虫感染的疫苗，并可能增强对其它顶复门（Apicomplexa）寄生虫的防护。