铜叶绿酸钠（Sodium Copper Chlorophyllin, SCC）通过多重抗病毒机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）感染

《Transboundary and Emerging Diseases》：Sodium Copper Chlorophyllin Inhibits Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Infection Through Multiple Antiviral Mechanisms

　　

摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）因其高度遗传多样性和疫苗交叉保护有限，仍是全球养猪业的重大威胁。亟需既能靶向病毒感染又能调控宿主病理反应的抗病毒策略。本研究评估了铜叶绿酸钠（Sodium Copper Chlorophyllin, SCC）对PRRSV感染的抗病毒功效及潜在机制。体外分析表明，SCC在Marc-145细胞和永生化猪肺泡巨噬细胞（immortalized Porcine Alveolar Macrophages, iPAMs）中对经典和高致病性PRRSV-2毒株均表现出强效、剂量依赖性的抑制作用。共处理（cotreatment）组抗病毒效果最强，表明SCC主要靶向病毒感染早期阶段。机制上，SCC可直接破坏病毒颗粒完整性，导致病毒RNA释放及感染性丧失；此外，SCC显著抑制病毒吸附、内吞及细胞内基因组复制，但不影响子代病毒释放。SCC还可降低猪巨噬细胞中PRRSV关键 entry受体CD163的表达，从而削弱病毒—宿主相互作用。进一步发现，SCC通过降低细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平、上调抗氧化基因[血红素加氧酶-1（Heme Oxygenase-1, HO-1）、NAD(P)H醌氧化还原酶1（NAD(P)H Quinone Oxidoreductase 1, NQO1）和谷氨酸—半胱氨酸连接酶修饰亚基（Glutamate–Cysteine Ligase Modifier Subunit, GCLM）]表达，并抑制促炎细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-8）产生，明显缓解PRRSV诱导的氧化应激与炎症反应。网络药理学分析提示氧化应激及代谢相关通路参与作用。重要的是，在PRRSV攻毒仔猪模型中，口服SCC可显著降低病毒载量、减轻发热并缓解肺组织病变。综上，SCC通过直接灭活病毒、抑制早期病毒进入及调节宿主反应发挥广谱抗PRRSV活性，有望成为防控PRRSV的候选治疗药物。

论文解读：铜叶绿酸钠（SCC）通过多重抗病毒机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染

研究背景与意义

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）是严重危害全球养猪业的经济性病原体，可致母猪繁殖障碍与仔猪严重呼吸道疾病，每年造成数亿至上亿美元损失。现有减毒活疫苗和灭活疫苗因PRRSV基因高度多样、免疫逃逸能力强及异源毒株交叉保护不完全，防控效果有限，且尚无批准用于猪只的临床抗病毒药物。PRRSV致病不仅源于病毒复制，还与感染巨噬细胞引发过度炎症激活及氧化应激密切相关，进而促进病毒持续感染和组织损伤。铜叶绿酸钠（Sodium Copper Chlorophyllin, SCC）为水溶性叶绿素铜复合物，已被报道具广谱抗微生物及抗肠道病毒A71（Enterovirus A71, EV-A71）活性，可通过抑制病毒附着与进入、氧化还原调节及金属离子介导的病毒成分破坏发挥作用，且临床前研究显示其安全性良好。鉴于氧化应激与炎症失调在PRRSV致病中的关键作用，研究人员假设SCC可通过同时靶向病毒感染过程与宿主病理反应发挥多功能抗病毒作用，因此开展本研究以探讨SCC抗PRRSV的功效与机制，并在体内验证其治疗效果。该研究成果发表于《Transboundary and Emerging Diseases》。

主要关键技术方法

研究人员采用以下主要实验技术开展工作：以Marc-145细胞、原代猪肺泡巨噬细胞（Primary Porcine Alveolar Macrophages, PAMs）及永生化猪肺泡巨噬细胞（immortalized PAMs, iPAMs）为细胞模型，以经典株CH1R、BJ-4及高致病株HuN4、Hn07-1、JXA1为PRRSV毒株；通过CCK-8法检测细胞毒性，设预处理（pretreatment）、共处理（cotreatment）及感染后处理（post-treatment）三种给药模式，以RT-qPCR定量PRRSV ORF7 mRNA、Western blot检测N蛋白、免疫荧光（Immunofluorescence Assay, IFA）观察病毒蛋白评价抗病毒效果；开展病毒直接灭活（virucidal）实验，通过绝对qPCR检测游离病毒RNA并结合TCID₅₀测定病毒滴度；分别进行吸附（4℃）、内化、复制及释放阶段特异性阻断实验，以RT-qPCR评估各阶段影响；用RT-qPCR及Western blot检测PRRSV关键受体CD163表达变化，并以蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂Bafilomycin A1（Baf-A1）区分降解途径；以DCFH-DA探针检测细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），RT-qPCR检测抗氧化基因HO-1、NQO1、GCLM及GSH试剂盒测还原型谷胱甘肽；RT-qPCR检测TNF-α、IL-6、IL-8炎症因子表达；通过网络药理学（CTD、GeneCards数据库取交集，STRING及Cytoscape构建蛋白互作Protein–Protein Interaction, PPI网络，GO与KEGG富集分析）预测作用靶点并RT-qPCR验证；体内实验采用4周龄PRRSV阴性仔猪（n=3/组），肌注高致病株HuN4攻毒，自1 dpi起口服SCC（50 mg/kg体重，每日1次×3天），监测体温与体重，RT-qPCR定量血清及肺组织病毒RNA，肺组织行H&E染色及大体与显微病变评分。

研究结果

3.1. SCC Exhibits Potent Antiviral Activity Against PRRSV In Vitro

研究人员在Marc-145及iPAMs中进行细胞毒性及抗病毒实验发现，SCC在≤300 μM浓度下无细胞毒性；三种处理方式均显著降PRRSV ORF7 mRNA、N蛋白表达及病毒滴度，其中共处理抑制最强；SCC呈剂量依赖性抑制病毒复制，且对经典株（CH1R、BJ-4）与高致病株（HuN4、Hn07-1、JXA1）均有广谱抑制效果。表明SCC在体外对多PRRSV-2毒株具强效、剂量依赖性抗病毒活性，共处理效果最佳。

3.2. SCC Exerts Direct Virucidal Activity Against PRRSV

将PRRSV与SCC孵育后感染细胞，发现随SCC浓度升高感染细胞中病毒RNA降低，而不经提取直接绝对qPCR检测到游离病毒RNA显著升高（200 μM时约升30倍），同时TCID₅₀病毒滴度降约10?倍。说明SCC可直接破坏PRRSV囊膜完整性致RNA释放及感染性丧失，具直接灭活病毒作用。

3.3. SCC Inhibits Multiple Stages of the PRRSV Life Cycle

吸附实验（4℃）显示SCC剂量依赖性减少结合于细胞的病毒颗粒（RT-qPCR及抗GP5抗体共聚焦证实）；内化实验中高浓度SCC显著抑制PRRSV内吞；SCC处理iPAMs及原代PAMs后CD163蛋白水平明显下降但mRNA无变化，且蛋白酶体抑制剂MG132可逆转此下调而Baf-A1不能，证明SCC通过泛素—蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）促进CD163降解；加入SCC于病毒进入后显著抑制胞内病毒RNA复制，而对子代病毒释放（加药于7 hpi后测上清病毒RNA）无影响。结论：SCC干扰PRRSV早期生命周期——抑制吸附、内吞及基因组复制，通过蛋白酶体途径下调CD163但不影响病毒释放。

3.4. SCC Mitigates Oxidative Stress Inflammatory Responses Induced by PRRSV Infection

PRRSV感染致细胞内ROS升高，SCC处理明显降ROS荧光强度，上调HO-1、NQO1、GCLM mRNA及HO-1蛋白表达，升细胞内还原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione, GSH）浓度；同时PRRSV诱导的TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA升高被SCC显著抑制。表明SCC通过增强抗氧化防御、抑制ROS积聚及下调促炎细胞因子，缓解PRRSV引发的氧化应激与炎症。

3.5. Network Pharmacology Analysis Identifies Host Pathways Involved in SCC-Mediated Antiviral Effects

取PRRSV相关宿主基因与SCC预测靶点交集得36个基因（含PPARG、IDH1、EGFR、INS等），PPI网络提示PPARG、EGFR、INS、IDH1为核心节点；GO富集涉及氧化应激应答、急性期反应及病毒过程负调控，KEGG富集涉及炎症与细胞能量代谢通路；RT-qPCR验证iPAMs中SCC上调PPARG与IDH1、下调EGFR、部分恢复INS至接近基线。说明SCC通过调控氧化应激、炎症及代谢相关宿主通路发挥抗病毒作用。

3.6. SCC Alleviates PRRSV Infection in Piglets

仔猪攻毒后，未处理感染组持续发热（>40.5℃）、典型呼吸道症状、肺出血水肿及间质肺炎组织学病变、血清和肺组织高病毒载量；SCC口服组发热延迟且短暂、临床症状减轻、大体及显微肺病变评分显著降低、血清与肺组织PRRSV RNA显著低于单纯攻毒组（p=0.0143），体重恢复略优但无统计学差异。证实口服SCC在体内可有效降病毒载量、缓解临床体征及肺病理损伤。

讨论与结论总结

讨论指出PRRSV因变异快、免疫逃逸及疫苗保护不全需补充抗病毒手段。本研究表明SCC兼具直接灭活病毒及宿主靶向调节作用，主要干扰PRRSV早期感染阶段（吸附、内化、复制），这与叶绿素衍生物普遍具病毒进入抑制特性相符；SCC可破坏病毒囊膜完整性致失活，与金属离子介导病毒膜 destabil化有关；SCC通过UPS途径下调关键受体CD163蛋白水平削弱病毒—宿主互作，属可逆药理学调控优于基因敲除；SCC同时上调HO-1/NQO1/GCLM、增GSH、降ROS，抑制TNF-α/IL-6/IL-8，重塑抗氧化与炎症平衡，使细胞环境不利于PRRSV复制；网络药理学鉴定PPARG、IDH1、EGFR等枢纽基因参与代谢与氧化还原调控；体内实验证实体口服SCC降病毒负荷、减轻发热与肺损伤且无可见不良反应，显示转化潜力，未来需开展剂量—效应、优化方案及与疫苗联用评估。

结论翻译：综上，本研究表明铜叶绿酸钠（SCC）是一种多功能抗病毒制剂，可通过病毒定向（直接破坏病毒颗粒及抑制早期进入）与宿主定向（下调CD163、缓解氧化应激与炎症）双重机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染。这些机制共同解释了体内病毒载量降低、临床症状缓解及肺病变减轻的观察结果。研究结果不仅阐明叶绿素衍生物抗病毒活性的机理，也确立SCC作为防控PRRSV具潜力的治疗候选物。