豆科作物是全球粮食安全的重要组成部分，既是植物性蛋白的重要来源，也在可持续农业实践中发挥重要作用。在豆科作物中，蚕豆（Vicia faba L.）因其高蛋白含量、广泛的气候适应性以及适于温带地区栽培而尤为突出。近年来，遗传工程，尤其是CRISPR/Cas9技术的进展，为提升豆科作物的营养性状与农艺性状开辟了新途径。研究人员概述了豆科作物中的基因编辑进展，并特别聚焦于迄今为止蚕豆遗传转化与基因编辑方面所取得的成果。最后，研究人员强调了若干可能具有蚕豆应用潜力的新策略。尽管近期已经取得进展，尤其是参考基因组序列的可获得性方面，但遗传转化顽固性（transformation recalcitrance）和基因型依赖性等重大挑战仍然存在。
1 Introduction
1.1 Importance of Legumes as a Protein Source and Their Role in Agriculture
文章首先阐述豆科作物在营养供给与农业生态系统中的基础性地位。豆科植物属于豆科（Fabaceae）大家族，是植物性蛋白、必需氨基酸、复杂碳水化合物、膳食纤维及微量营养素的重要来源；同时，凭借生物固氮作用，豆科作物能够改善土壤肥力、降低化肥投入并减轻农业环境负担。由于其蛋白含量通常可达20%–45%，且氨基酸组成可与谷物形成互补，豆科被视为替代动物蛋白的重要作物类型，并与更健康的膳食结构和较低的心血管代谢疾病风险相关。在农业生产层面，豆科作物还能通过优化轮作体系、抑制病虫害和提升系统生产力来支撑可持续农业。
随后，文章指出，尽管豆科作物具有显著的营养和农艺优势，但其在许多地区仍未得到充分利用，全球消费水平相较于动物源食品仍然偏低。在温带地区，这一问题尤为突出，因为食品和饲料蛋白供应在很大程度上依赖进口大豆（Glycine max），而大豆栽培又受限于日长和温度要求。因此，提高区域蛋白自给率，需要扩大适应当地环境的食用豆科作物种植规模，其中包括蚕豆（Vicia faba L.）和豌豆（Pisum sativum）。
在温带粒用豆科作物中，蚕豆因富含蛋白和赖氨酸、适应冷凉气候、耐受较贫瘠土壤并能显著提升土壤氮输入而具有独特优势。其种子蛋白含量可达约30%，既可直接食用，也可加工为面粉、配料或植物基食品中的蛋白来源。然而，与大豆和鹰嘴豆等主要豆类商品相比，蚕豆长期在全球市场中处于相对边缘地位，这与育种投入不足和遗传改良进展较慢密切相关。高质量蚕豆参考基因组的发布重新激发了研究兴趣，也为加速其遗传改良、优化转化与再生体系提供了关键基础。
在此背景下，文章提出遗传工程可作为传统育种的重要补充，用于解决蚕豆在生物胁迫、非生物胁迫、品质性状和农艺表现等方面的关键限制。其他粒用和饲用豆科作物中已经通过转基因技术实现了抗虫、抗病、耐除草剂、营养品质改良和细胞壁成分调控等目标，这些成功案例为蚕豆的遗传增强提供了可借鉴路径。
2 Genetic Enhancement of Major Food Legumes
2.1 Transgenic Legumes and Their Application
2.1.1 Examples of Cultivated Transgenic Legumes
该部分概述了主要豆科作物中已实现的转基因性状及其应用价值。文章指出，豆科作物栽培面临的核心问题包括病虫害防控、除草剂耐受、营养成分改善和环境可持续性，而转基因技术已在多个作物中针对这些问题取得进展。例如，导入苏云金芽孢杆菌（Bt）来源的Cry1Ac基因可赋予大豆对鳞翅目幼虫的毒性，从而降低化学杀虫剂依赖；携带Bt Cry2Aa基因的转基因豇豆（Vigna unguiculata）可抵御Maruca荚螟；导入Bar基因的小扁豆（Lens culinaris）获得草铵膦耐受性；降低咖啡酰辅酶A 3-O-甲基转移酶（CCOMT）表达的紫花苜蓿（Medicago sativa）木质素含量下降，改善饲料消化率；导入DREB1A与Cry2A2基因的鹰嘴豆（Cicer arietinum）同时增强抗旱与抗虫能力；导入豌豆卷叶花叶病毒（PEMV）外壳蛋白基因的豌豆（P. sativum）获得抗病性；而Roundup Ready大豆则通过导入cp4 epsps基因实现草甘膦耐受。整体而言，这些案例证明豆科作物的遗传工程不仅能够提升产量稳定性，还能减少农药和耕作投入，为蚕豆等利用不足作物提供了重要技术参照。
2.2 Technologies and Resources Enabling Legume Genetic Engineering
本节强调，豆科遗传改良正从传统系谱选择和表型选择，转向依托基因组学、高通量表型组学与精准育种的综合技术体系。文章指出，标记辅助选择、基因组选择与基因编辑正共同加快豆科作物改良进程，而泛基因组学（pan-genomics）、多组学（multiomics）、CRISPR/Cas工具箱及快速育种（speed breeding）构成了新一代豆科遗传工程的核心支撑。
2.2.1 Genome Editing
文章系统总结了基因编辑技术的发展脉络及其在豆科中的意义。CRISPR-Cas系统因易用性、准确性和模块化特征成为当前首选的基因编辑平台。除经典Cas9外，工具箱已扩展至Cas12a（Cpf1）、高保真Cas9、碱基编辑（base editing）、先导编辑（prime editing）、表观基因组编辑以及CRISPRi/a等系统。其功能覆盖单碱基替换、插入、缺失乃至染色体重排等多种遗传变异形式。文章进一步解释，经典Cas酶通过诱导双链断裂（DSB）并依赖非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）实现基因改变，其中HDR在植物中效率较低，因此提高体细胞HDR效率仍是重要研究方向。碱基编辑和先导编辑则通过减少对断裂修复的依赖，提高了编辑结果的可控性。总体来看，CRISPR/Cas平台已显著提升作物性状解析与精准改良的能力。
2.2.2 Speed Breeding
文章指出，快速育种通过控制光周期、温度、光照强度和养分供给，可显著缩短豆科作物世代周期，从而支持更快的基因组选择、纯合系固定和工程材料创制。对于世代周期较长、光周期敏感的豆科作物，这一技术尤其重要。文中列举了大豆、鹰嘴豆和小扁豆在长光照条件下实现一年多代繁殖的实例，并说明快速育种可服务于编辑等位基因快速纯合、多个编辑性状的聚合以及与自动成像和表型组平台结合开展高通量筛选。该技术与基因编辑结合，被认为能够显著提高性状发现与优良材料导入的效率。
2.2.3 Pan-Genomics and Multiomics
文章进一步讨论了泛基因组和多组学对豆科遗传工程的推动作用。泛基因组整合了同一物种不同栽培种和种质资源中的全部遗传变异，有助于从野生近缘种或未充分利用材料中发掘抗逆相关基因。转录组学、蛋白质组学、代谢组学及相关“组学”技术则从系统层面揭示生长、共生固氮和胁迫适应的分子基础。高分辨率基因组资源结合比较基因组学可更精准地锁定候选基因和调控元件；转录组数据有助于解析结瘤及胁迫应答中的时空表达动态；蛋白质组和代谢组则为功能验证和通路调控提供支持。多组学整合因此能够优化转化载体设计，并提高工程改造结果的可预测性。
2.3 Potential Engineering Targets for Faba Bean
本节聚焦蚕豆的潜在工程靶标。文章指出，限制蚕豆广泛栽培与消费的关键因素主要包括抗营养因子（antinutrients）和异味（off-flavors）。在蚕豆完整参考基因组发布后，针对这些性状开展精准育种和基因编辑已具备重要前提。
2.3.1 Protein Content and Quality
关于蛋白含量与品质，文章指出蚕豆作为冷季豆科作物具有约30%的较高种子蛋白含量，但提升蛋白含量常伴随产量代价。储藏蛋白合成受氮、碳资源制约，并与淀粉和脂质积累竞争底物，因此通过调控碳氮同化和代谢流分配来提高蛋白积累是重要方向。文中提到，通过调节根瘤数量相关的CLE肽等位基因，可在大豆中实现蛋白含量提升且不产生产量惩罚，这为蚕豆提供了靶标思路。在蛋白品质方面，蚕豆主要储藏蛋白为球蛋白（globulins），其含硫氨基酸（SAA）如蛋氨酸和半胱氨酸含量不足。可考虑通过硫酸盐转运体、含硫氨基酸生物合成酶或富含SAA的储藏蛋白相关基因进行调控，但需注意氨基酸途径耦联可能引起其他氨基酸组成变化。
2.3.2 Antinutrients
文章将蚕豆的主要抗营养因子归纳为蚕豆嘧啶糖苷类、胰蛋白酶抑制剂、凝集素、植酸和单宁。蚕豆嘧啶糖苷中的蚕豆嘧啶苷和伴蚕豆嘧啶苷（vicine/convicine, V-C）与蚕豆病相关，而VC1基因的鉴定为降低V-C含量提供了突破口；不过，Hedin基因组中VC1存在串联重复拷贝，增加了完全敲除的难度。胰蛋白酶抑制剂由小型多基因家族编码，在大豆中已通过CRISPR/Cas9成功降低其活性且无明显农艺惩罚，提示蚕豆可借鉴类似的多重编辑策略。凝集素（lectins）同样由多基因家族编码，可通过编辑种子特异性凝集素基因（LEC）降低肠道不适风险。植酸作为磷贮藏形式会螯合铁、锌、钙等矿物元素，影响生物有效性，其通路中的IPK和MIPS等同源基因是潜在编辑对象。单宁则通过与蛋白和矿物质形成复合物降低营养利用率，ZT1、ZT2以及类黄酮合成通路上游基因如CHS可用于精细调控单宁和相关多酚含量。
2.3.3 Off-Flavors
在异味改良方面，文章指出蚕豆制品的豆腥味和苦味显著限制其消费与加工利用。脂质氧化产生的挥发性和非挥发性化合物是“豆腥味”的主要来源，相关关键靶点包括脂氧合酶（LOX）和脂肪酸去饱和酶（FAD）。在大豆中抑制lox表达已成功减轻豆腥味，说明蚕豆同源基因值得重点关注。与苦味相关的多酚和皂苷则涉及苯丙烷途径和三萜途径中的zt、chs、chi及β-香树脂醇合酶（BAS1）等基因；此外，多酚氧化酶（PPO）和氢过氧化物裂解酶（HPL）也可能影响氧化产物组成。文章认为，多靶点CRISPR编辑结合高通量感官表型鉴定可加快低异味性状导入，但仍需关注与抗虫性等性状之间的权衡。
2.3.4 Biotic Stress Tolerance
在生物胁迫方面，文章概述了蚕豆受到真菌和卵菌病害、列当属寄生杂草及昆虫害虫的严重威胁。传统育种虽已定位若干数量性抗性位点（QTL），但导入过程缓慢且可能伴随连锁累赘。遗传工程可通过增强病原识别和信号转导来提升抗性，例如优化抗病基因（R genes）、模式识别受体（PRRs）、NLR及WRKY转录因子等；也可通过编辑易感基因（S genes）削弱病原利用宿主的能力。对于昆虫和线虫抗性，可将传统抗性QTL与工程化蛋白酶抑制剂或Bt毒素策略结合。对于列当属寄生杂草，则可考虑靶向独脚金内酯分泌或根表识别相关基因，以降低寄生附着。
2.3.5 Abiotic Stress Tolerance
在非生物胁迫部分，文章强调蚕豆对干旱和高温较为敏感，尤其开花期受害显著。转基因策略可通过增强活性氧（ROS）清除、提高抗氧化水平、维持光合作用和促进渗透调节来提升耐逆性。文中提到，在蚕豆中异源表达马铃薯PR10a基因可增强耐旱和耐盐能力，表现为更好的生长恢复、更高的叶绿素含量、光系统II效率（?PSII）和气体交换速率。在相关豆科作物中，DREB1A、P5CSF129A和TaBADH等基因也已显示出良好应用潜力。随着蚕豆基因组资源的完善，DREB、LOX及NCED3等基因被视为未来通过多重编辑提升复合胁迫耐受性的候选靶标。
3 Current Status and Opportunities in Genetic Engineering of Faba Bean
3.1 Current Status of Genetic Transformation in Faba Bean
3.1.1 Agrobacterium-Mediated Transformation
文章指出，根癌农杆菌（A. tumefaciens）介导转化是蚕豆遗传工程最早实现稳定转化的途径之一。早期研究已利用节间茎段实现蚕豆稳定遗传转化，随后也有在其他Vicia物种中获得转化与再生的报道。发根农杆菌（A. rhizogenes）则已用于VC1功能验证的毛状根体系，但尚未形成可稳定再生完整植株的成熟流程。
3.1.2 Particle Bombardment
粒子轰击（biolistics）作为另一种导入外源DNA的方法，已在蚕豆中建立初步方案，并在Tiffany和Hedin品种中获得一定转化效率。尽管部分T
0事件可向T
1代传递转基因，但该方法存在实验波动较大、多拷贝插入和DNA完整性受损等限制。文中还提到，面向分生组织L2层的无DNA in planta粒子轰击（iPB）策略，利用核糖核蛋白（RNP）递送编辑试剂，为获得可遗传编辑提供了新的方向。
3.1.3 Electric Current-Mediated Genome Editing in Faba Bean
电流介导基因编辑通过施加电流增加细胞壁和细胞膜通透性，使RNP复合物或质粒载体进入完整且可再生组织。文中介绍，该方法已被用于蚕豆胚中导入绿色荧光蛋白（GFP）构建体，并以八氢番茄红素脱氢酶（PDS）为内源靶标，在T
0阶段获得50%的嵌合突变率。该方法兼容叶片和胚组织，显示出无外源DNA编辑的应用潜力。
3.1.4 Plant Regeneration
文章强调，蚕豆遗传转化的根本瓶颈之一在于再生能力差。已有研究尝试使用胚、子叶节、愈伤组织、不定芽、根和原生质体等不同外植体开展再生，但多数体系存在周期长、实验室间难以转移以及体细胞变异等问题。已有研究发现，较低培养温度、活性炭、抗坏血酸、柠檬酸及壳聚糖等处理可缓解组织培养中的酚类褐变问题；噻苯脲（thidiazuron）在芽诱导中表现突出，但常抑制生根；NAA、嫁接及后续优化的IAA体系有助于完整植株获得。最新研究提出了适用于多达33个品种的通用再生方案，其中1.5 mg/L IAA被认为是同时诱导芽和根形成的关键因素。总体上，蚕豆再生虽可实现，但仍表现出明显的缓慢性和基因型依赖性。
3.2 Optimizing Genome-Editing Reagents
该部分讨论如何在转化和再生效率有限的前提下，最大化蚕豆编辑效率。文章指出，gRNA启动子与Cas启动子的选择至关重要。U3和U6是豆科中常用的gRNA启动子，但物种特异性启动子通常能够带来更高、更稳定的编辑效率，特别是在多gRNA构建中。对于Cas9表达，尽管CaMV35S和泛素启动子常用，但本源强启动子或细胞/组织特异启动子可能更为理想，且有望减轻组成型表达导致的多效性。文章还总结了Cas9密码子优化、内含子化（intronized）设计以及Cas12a等变体的潜力，认为这些策略有助于提升蚕豆基因组中冗余序列和AT富集区域的编辑适配性。与此同时，在稳定转化前先利用毛状根等快速体系预验证gRNA效率，也被视为降低成本和提高成功率的重要步骤。
3.3 Methods Not yet Applied in Faba Bean
文章最后综述了若干尚未在蚕豆中充分应用、但具有前景的新型递送与再生促进策略，包括电穿孔（electroporation）、脂质纳米颗粒（LNP）递送、冲击波递送、超声介导递送（sonoporation）、纳米材料与细胞穿透肽（CPP）递送，以及外源生长调控因子辅助再生等。其共同目标在于实现更高效、更低损伤、无DNA的编辑试剂导入，并缓解豆科作物普遍存在的组织培养难题。文章特别强调，WUS、WOX、BBM、SERK、LEC及GRF-GIF等发育调控因子在豆科中的应用，提示通过激活体细胞胚发生或从头分生组织形成，可能显著提高蚕豆再生与转化效率；此外，植物肽和代谢物如植物磺基激肽α（PSK）、AMP及REF1也展现出提升再生能力的潜在价值。
4 Conclusion
结论部分认为，2023年蚕豆参考基因组的发布是该作物精准育种的关键转折点。未来蚕豆遗传工程的发展，需要围绕几个核心方向展开：一是构建更适合蚕豆的编辑试剂体系，包括内源强启动子、优化Cas变体和高效gRNA表达模块；二是建立瞬时与稳定相结合的编辑效率评价系统；三是进一步提升无DNA递送与整株再生效率；四是借助自动化和机器学习优化培养基筛选与再生条件解析。总体而言，尽管蚕豆遗传工程仍受制于转化顽固性与基因型依赖性，但随着基因组资源、递送技术、再生调控和高通量表型分析的不断进步，其在培育高营养、高抗逆和更可持续利用新品种方面具有显著前景。
