空气传播环境DNA过滤在温带混交林中对陆生脊椎动物检测优于叶片拭子，且过滤时间越长效果最佳

《Methods in Ecology and Evolution》：Filtration of airborne eDNA outperforms leaf swabs for terrestrial vertebrate detection in a temperate mixed forest with longer filtration times performing the best

　　

通过主动空气过滤和植被采样（叶片拭子）收集环境DNA（eDNA）的进展已证明利用空气传播eDNA进行陆生脊椎动物调查的前景。然而，这些方法仍处于早期阶段，研究人员缺乏对空气过滤时间效应以及两种采样方法在表征脊椎动物群落方面互补性的深入了解。在此，研究人员在丹麦的温带森林中分别进行了24小时、48小时和96小时的空气传播eDNA过滤，并使用12S鸟类和16S哺乳动物标记的DNA宏条形码评估主动空气传播eDNA过滤时长如何影响脊椎动物检测。此外，研究人员评估了24小时主动空气传播eDNA过滤与叶片拭子之间的互补性。研究人员发现空气过滤时间与分类单元丰富度之间存在强正相关。平均而言，96小时采样每份样本检测到24个野生脊椎动物分类单元，而24小时采样每份样本平均获得15个野生分类单元。增加采样时间还导致样本间群落更均质化。然而，24小时采样获得了最高总野生分类单元数（66个分类单元），而48小时和96小时采样分别捕获60个和55个分类单元。由于研究人员收集了40份24小时样本、20份48小时样本和10份96小时样本，这可能反映了所分析样本数量的影响。与过滤空气样本相比，叶片拭子每份样本检测到的脊椎动物分类单元更少（平均1.5个）。总之，空气过滤优于叶片拭子，更长的空气过滤时间在温带森林中产生了更多样且更一致的脊椎动物群落。这为使用主动空气传播eDNA过滤和叶片拭子进行生物多样性调查、生态研究、保护、自然管理项目等提供了见解。

**研究背景与问题**
环境DNA（eDNA）技术的进步已鉴定出多种用于调查陆生脊椎动物生物多样性的环境底物类型，包括土壤、水、无脊椎动物肠道内容物及空气颗粒物。其中，空气颗粒物的DNA分析通过植被拭子（叶片拭子）、空气颗粒物主动过滤、蜘蛛网收集等方法已被用于陆生脊椎动物调查。然而，这些方法仍处于早期阶段，需要改进以提高分类检测的稳健性，并评估不同收集方法的互补性。目前，多数采用主动空气过滤的研究采样时间较短（约30分钟至24小时），而对更长时间（如7天）采样的研究则较少。尽管过滤时长可能对提高脊椎动物检测有潜在影响，但其对表征脊椎动物群落的效果尚未被评估。此外，与主动空气过滤相比，叶片拭子（即收集植被上累积的空气传播脊椎动物eDNA）所需设备较少且无需电源，但其有效性是否在全球范围内一致尚待确定。因此，本研究旨在探究空气传播eDNA过滤时长（24、48、96小时）对温带混交林中脊椎动物检测的影响，并评估主动过滤与叶片拭子在表征脊椎动物群落方面的相似性或互补性。

**研究内容与结论**
研究人员使用定制便携式空气采样器（首次由Lynggaard等描述，经Bodawatta等改进），在丹麦Lille Vildmose自然保护区内的Tofte森林（温带混交林）设置10个采样点，每个采样点部署三台采样单元分别运行24、48、96小时。同时，在每次24小时采样结束后，从每个采样点收集叶片拭子（共40份）。采用12S鸟类标记（BirT）和16S哺乳动物标记（16Smam）进行DNA宏条形码分析，并比较不同过滤时长和采样方法的效果。结果显示：空气过滤时间与每份样本的脊椎动物分类单元丰富度呈强正相关（96小时采样平均24个分类单元，显著高于48小时的18.5个和24小时的15.3个）；但24小时采样（40份样本）获得了最高的总分类单元数（66个），而48小时（20份）和96小时（10份）分别获得60个和55个，这可能与样本数量不均有关。在群落组成上，不同过滤时间之间无显著差异，但采样点有显著影响。叶片拭子每份样本仅检测到平均1.5个野生脊椎动物分类单元，远低于24小时空气过滤的15.3个，且其物种累积曲线远未达到平台期。研究结论表明：主动空气过滤优于叶片拭子，更长的过滤时间（96小时）能更高效、更一致地检测温带森林中的脊椎动物群落，所需样本数量更少，成本效益更高。该研究为生物多样性调查、生态研究、保护和自然管理项目中空气传播eDNA主动过滤与叶片拭子的应用提供了重要见解。论文发表在《Methods in Ecology and Evolution》。

**关键技术方法**
（1）**空气传播eDNA主动过滤**：使用定制便携式空气采样器（含12V辅助风扇、ISO ePM10_65%微纤维空气过滤器，流速约3.49 m³/h），在10个采样点分别运行24、48、96小时，共获得70份滤膜样本（24小时40份、48小时20份、96小时10份）。采样在丹麦Tofte森林（混合温带森林）进行，天气条件相对稳定（平均温度18.2°C，湿度87.1%，无降水，风速2.8 m/s）。
（2）**叶片拭子收集**：在每个采样点使用无菌棉签蘸取Longmire缓冲液擦拭叶片表面3分钟，每次与24小时滤膜收集同步，共40份样本。
（3）**DNA宏条形码分析**：使用12S rRNA标记（BirT，约260 bp）和16S rRNA标记（16Smam，约90 bp）进行PCR扩增，每个DNA提取物设6个PCR重复，构建双索引Illumina文库并在NovaSeq 6000上测序。测序数据经质量过滤、OTU聚类（97%相似度）、BLAST比对注释，去除人类和家养动物序列后获得野生脊椎动物分类单元。

**研究结果**
**3.1 主动过滤空气样本检测到当地脊椎动物群落**
通过全部70份空气滤膜样本，12S标记获得12,744,554条序列，鉴定出54种野生鸟类分类单元（47种鉴定到种）；16S标记获得1,050,308条序列，鉴定出18种野生哺乳动物（16种到种）和1种两栖动物（普通蟾蜍）。共73个野生脊椎动物分类单元。空气样本检测到2013年基线调查中44种鸟类的22种（50%），还额外检测到25种未在基线调查中记录的物种，包括森林、海岸及草原鸟类。哺乳动物方面，检测到5个蝙蝠属中的2个（Pipistrellus和Myotis）。

**3.2 增加空气传播eDNA过滤时长提高脊椎动物分类单元丰富度**
96小时空气样本每份平均检测24个野生脊椎动物（SD=5.9），显著高于48小时（18.5）和24小时（15.3）（线性混合模型，p<0.0001）。但24小时采样（40份）获得最多的总分类单元（66个），48小时（20份）为60个，96小时（10份）为55个，这可能由于样本量不均。稀薄化与外推曲线显示，96小时采样以更少的样本（10份）达到了更高的丰富度。不同过滤时间之间脊椎动物群落组成无显著差异（PERMANOVA，p=0.2424），但采样点有显著影响（p=0.0003），且未发现空间自相关。巢式分析显示，96小时样本与24小时样本相比有显著分类单元增益。

**3.3 空气过滤比叶片拭子产生更多样的脊椎动物群落**
40份叶片拭子中，30份检测到野生脊椎动物，共31个分类单元（9种哺乳动物、22种鸟类），每份平均1.5个（SD=1.28），显著低于24小时空气过滤的15.3个（p<0.0001）。24小时空气样本与叶片拭子共享30个分类单元，空气样本独有36个，叶片拭子独有1个（赤狐）。群落组成在两种方法间差异显著（PERMANOVA，p<0.0001），且采样事件（天数）对两种方法均有显著影响。叶片拭子的稀薄化曲线未达到平台期，表明需要更多样本才能充分捕获脊椎动物多样性。

**总结讨论**
研究人员发现，增加主动空气过滤时长（96小时）能提高每份样本的脊椎动物检测量，且样本间群落更一致。96小时采样比24小时和48小时更经济高效，但更长时间可能导致DNA降解并掩盖时间变异。空气过滤检测到多种体型、生态位和丰度的脊椎动物，但漏检了一些物种（如驼鹿），这可能受动物数量、栖息地选择及空间尺度影响。叶片拭子效率较低，但其采集简便，可通过增加样本数量或预提取混合来弥补。不同地理区域叶片拭子效果差异显著，需进一步研究原因。总体而言，主动空气过滤在温带森林中优于叶片拭子，为未来生物多样性调查提供了方法学指导。

**研究结论**（翻译自原文Conclusions部分）
使用主动空气过滤或植被拭子收集eDNA进行陆生脊椎动物调查仍处于早期发展阶段，需要优化以提高检测率和成本效益。在此，研究人员发现，在温带森林中，增加主动空气过滤时长能获得更多样且更一致的脊椎动物群落检测。此外，空气过滤每份样本的野生脊椎动物检测率高于叶片拭子。综合来看，空气过滤需要收集和处理的样本更少，因此更具成本效益。然而，由于叶片拭子收集所需工作量较少，增加拭子样本数量是可行的。通过样本预提取前混合拭子，可缓解因样本数量增加而带来的实验室处理成本和劳动力增加。总之，研究结果为从业者在生物多样性调查、生态研究、保护和自然管理项目中利用主动空气传播eDNA过滤和叶片拭子进行脊椎动物检测提供了新的成本效益见解。