(-)-α-侧柏酮((-)-α-thujone)介导储粮害虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)应答刺激物回避行为的多模态靶标

《Pest Management Science》：Multimodal targets of (-)-α-thujone mediating avoidance behavior of a stored-products pest, Tribolium castaneum, in response to irritant stimuli

　　

背景：植食性昆虫与宿主植物间的互进化过程涉及昆虫对植物防御化学物质（如萜类化合物）的宿主转移，萜类是导致适应性辐射和化学感受器多样化的关键因子。为揭示昆虫应答刺激物回避行为所涉及的多元模态(multimodal)化学感受靶标，本研究以双环单萜化合物(-)-α-thujone为对象，以赤拟谷盗(Tribolium castaneum)为模式昆虫探讨其多模态靶分子。结果：区域偏好性测试显示成虫对(-)-α-thujone有明显回避行为。研究人员利用系统性RNA干扰(RNAi)敲低候选靶标基因：敲低由γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)激活受体中的抗狄氏剂(resistance to dieldrin, Rdl)亚基编码基因(TcRdl)，显著抑制了对(-)-α-thujone而非l-薄荷醇(l-menthol)的回避行为；敲低温敏瞬时受体电位(transient receptor potential, TRP)通道(TcTRPM)及非温敏TRP通道(TcTRPL)也显著抑制回避行为。定量反转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)空间表达分析显示TcRdl转录本头部表达最高，其次为触角；TcTRPL转录本在头部显著高表达。触角切除及嗅觉受体共受体(olfactory receptor co-receptor, Orco；TcOrco)基因敲低后回避行为减弱，证实触角参与该机制。结论：结果表明非温敏TRP通道等潜在分子靶标参与了(-)-α-thujone介导的赤拟谷盗回避行为，并显示出与驱避剂金标准N,N-二乙基-3-甲基苯甲酰胺(N,N-diethyl-3-methylbenzamide, DEET)相似的多模态特征，可为新型驱避剂及兴奋驱避剂(excito-repellent)研发提供参考。

《(-)-α-侧柏酮((-)-α-thujone)介导储粮害虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)应答刺激物回避行为的多模态靶标》论文解读

本研究发表于《Pest Management Science》。植食性昆虫与宿主植物在互进化过程中，植物次生代谢物（尤其是萜类，已发现约50,000种）常作为防御物质对昆虫产生神经毒性或驱避/刺激（irritant stimuli）作用，诱导昆虫产生回避（avoidance）行为。目前驱避剂金标准为N,N-二乙基-3-甲基苯甲酰胺（DEET），其作用机制存在嗅觉阻断、化学感受检测及神经毒性三假说，被认为具多模态作用方式（multimodal mode of action, MoA），提示多模态是下一代驱避剂和兴奋驱避剂（excito-repellent，接触后引起动物远离刺激物的物质）的重要特征。瞬时受体电位（transient receptor potential, TRP）通道是保守的伤害性感受器（nociceptor），可感知有毒化学物质、温度及机械刺激；昆虫GABA门控氯离子通道含抗狄氏剂（resistance to dieldrin, Rdl）亚基，是芬普尼（fipronil）等杀虫剂靶标，(-)-α-thujone为双环单萜，文献提示其为GABA_A型受体拮抗剂并可诱导果蝇回避行为，但是否在储粮害虫赤拟谷盗中通过多模态化学感受靶标诱导回避尚不明确。本研究旨在通过RNA干扰（RNA interference, RNAi）敲低候选基因，阐明(-)-α-thujone诱导赤拟谷盗回避行为的分子靶标。

主要关键技术方法：

研究人员以实验室种群赤拟谷盗（Tribolium castaneum）为材料，采用全身cDNA克隆获得TcRdl及TcTrpl全长编码序列并构建质粒验证；通过蛹期微注射双链RNA（dsRNA）实现TcRdl、TcTRPL、TcTRPM及TcOrco的系统RNAi敲低，以注射/未注射增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）dsRNA及未注射成虫为对照；利用qRT-PCR验证敲低效率及TcRdl、TcTRPL在各组织（头、触角、胸、腹、足）的空间表达；开展区域偏好性测试（area-preference test）评估成虫对滤纸半面涂布(-)-α-thujone（及对照l-薄荷醇）的回避指数（avoidance index, AI）；对部分成虫进行触角切除手术或TcOrco敲低后重复区域偏好性测试；以芬普尼（fipronil）点滴处理腹部腹面开展接触毒性测定，用Kaplan–Meier生存分析及log-rank检验评估TcRdl敲低对芬普尼敏感性的影响。

研究结果

3.1 对(-)-α-thujone的回避行为（Avoidance behavior in response to (-)-α-thujone）：

研究人员通过区域偏好性测试发现，赤拟谷盗成虫对1、2.5、5 μmol cm^?2三个浓度的(-)-α-thujone均表现显著回避行为（P < 0.01或P < 0.001），后续实验选用2.5 μmol cm^?2进行。

3.2 TcRdl敲低的影响（Effects of TcRdl knocking down）：

qRT-PCR证实dsTcRdl注射使蛹羽化成虫的TcRdl转录水平较对照降低约70%（P < 0.001）。该敲低组对(-)-α-thujone的回避指数显著低于对照组（P < 0.001），但对单环单萜l-薄荷醇（l-menthol）的回避行为无显著影响（P = 0.9933）。芬普尼接触毒性实验显示，TcRdl敲低组在施药后12 h死亡率显著低于dsEGFP对照组（Log-rank检验 P < 0.0001），24 h死亡率无显著差异，表明TcRdl为(-)-α-thujone及芬普尼共同靶标之一。结论：TcRdl（GABA受体Rdl亚基）参与(-)-α-thujone介导的特异性回避行为。

3.3 TcTRPL和TcTRPM敲低对(-)-α-thujone回避行为的影响（Effects of TcTRPL and TcTRPM knockdown on the avoidance behavior toward (-)-α-thujone）：

qRT-PCR确认dsTcTRPL和dsTcTRPM分别显著降低对应转录水平（均P < 0.001）。TcTRPL或TcTRPM单独敲低均使成虫对(-)-α-thujone的回避指数显著下降（均P < 0.001）。结论：热敏TRP通道（TcTRPM）及非热敏TRP通道（TcTRPL，属TRPC亚家族）均参与(-)-α-thujone诱导的回避行为，此为首次报道植物源化合物通过TRPL介导昆虫回避行为。

3.4 TcRdl和TcTRPL的相对表达水平（Relative expression levels of TcRdl and TcTRPL）：

组织表达分析显示TcRdl在头部转录丰度最高，触角次之（P < 0.001），腹、胸、足较低；TcTRPL在头部显著高表达（P < 0.001），其他组织极低。结论：TcRdl与TcTRPL主要表达于头部（可能含中枢神经系统）及触角，与该化合物可能在中枢及外周均发挥作用相符。

3.5 触角参与(-)-α-thujone回避行为（Involvement of the antenna in avoidance behavior toward (-)-α-thujone）：

触角切除成虫的回避指数约为完整成虫的一半（Welch's t检验 P < 0.05）；TcOrco敲低成虫回避指数亦显著低于未处理组（Student's t检验 P < 0.001），qRT-PCR证实TcOrco转录下调。结论：触角及Orco依赖的嗅觉感受机制参与(-)-α-thujone回避行为，但TcOrco敲低后仍有弱回避，提示嗅觉受体并非唯一主导途径。

讨论与结论总结：

讨论指出，(-)-α-thujone在赤拟谷盗中通过多模态靶标介导回避行为——包括GABA激活受体的Rdl亚基（TcRdl）、非热敏TRP通道TcTRPL及热敏TRP通道TcTRPM，以及Orco依赖的触角嗅觉感受通路，类似DEET所具多模态特征。TcRdl敲低减弱芬普尼致死效应延迟说明其为已知杀虫剂共同靶标；TRPL首次被证明介导植物源化合物的回避反应；触角切除及TcOrco敲低部分抑制回避，说明嗅觉通路参与但非完全主导，头部高表达的TcRdl和TcTRPL提示中枢或直接接触刺激途径亦重要。研究局限为行为学层面，后续需在分子/细胞水平明确(-)-α-thujone与各受体间相互作用。

结论原文翻译：研究人员基于赤拟谷盗行为学实验，确定TcRdl、TcTRPL、TcTRPM及TcOrco为(-)-α-thujone潜在的多元模态靶标。结果为了解(-)-α-thujone的作用机制（MoA）提供了有价值见解，有助于开发保护作物免受害虫侵害的新型有效防控策略。