《Organic Chemistry Frontiers》：High-throughput hydrogen isotope exchange via transfer deuteration
近年来，高通量实验（high-throughput experimentation, HTE）因其在反应条件快速优化方面的优势而受到广泛关注。然而，由于实际操作限制，氘气（D?）在孔板格式中的应用相对较少。研究人员开发了一种基于转移氘代条件的快速筛选方案，以甲酸-d?（formic acid-d?）作为氘源替代氘气。研究表明，这些条件允许以受控且安全的方式快速筛选多达96个氢同位素交换（hydrogen isotope exchange, HIE）反应。结合脚本程序，该平台可实现分析数据的快速处理和可视化，最终能够极为快速地筛选标记化合物的条件，如活性药物成分（active pharmaceutical ingredients, APIs）的氘代标记条件。
**研究背景与问题提出**
氘代化合物具有广泛的应用，从提高药物候选物的代谢稳定性到机理研究均有涉及。近十年来，由于氘代药物的发展，氘代化合物尤其受到关注。氢与其较重稳定同位素的替换可对分子的药代动力学（pharmacokinetic, PK）和代谢特性产生深远影响，从而改变其药物性质。例如，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）于2017年批准氘代丁苯那嗪（deutetrabenazine，即丁苯那嗪的氘代版本），2022年批准氘可来昔替尼（deucravacitinib）。氘代丁苯那嗪中六个质子被氘原子取代，延缓了化合物代谢，使得剂量和给药频率得以降低。氘还常用于概念验证标记，在将氚引入分子之前进行氘代，并用于制备稳定同位素标记的内标物（stable-isotope-labeled internal standards, SILs），以供基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的生物分析定量研究。氚标记药物同位素异构体在早期发现阶段用于结合研究和药物候选物分析，包括初始代谢研究；在后期药物开发中，氚代类似物可用于临床前动物实验以研究药物候选物的药代动力学特征。
目前已有多种氘和氚标记方法被开发，包括双键还原、脱卤反应以及含氢同位素基团的引入。过渡金属催化的氢同位素交换（HIE）是一种宝贵且常用的方法。尽管这种碳-氢键（C–H）活化方法需要导向基团，但其具有良好的官能团耐受性，并可在温和条件下实现后期标记，这对于制备氘代或氚代药物衍生物尤为有价值，因其可显著节省时间和成本资源。用于此转化的金属络合物通常基于铂（Pt）、铑（Rh）、钌（Ru）和铱（Ir）。其中，邻位导向的芳香族HIE最为常见，且以铱催化为主导，近年来多数例子使用Kerr及其同事开发的含氮杂环卡宾（N-heterocyclic carbene, NHC）的铱催化剂。
氘标记常以氘水（D?O）为氘源进行，因其成本低、易用且易获得。但某些反应因其反应机理需要使用氘气氛围而非氘水。例如，Kerr课题组开发的HIE催化剂需与氘气或氚气配合使用。此外，氚化反应主要以氚气（T?）进行，因T?O处理风险较高且T?使用更为便捷；氚气与T?O不同，还具有接近理论摩尔活度的优势，使其适用于更广泛的应用。氘气通常用于测试反应可行性，作为T?的模拟以减少放射性材料的浪费。因此，氘气是2017至2021年间出版文献中第二常用的氘源。
1996年，Noyori及其同事报道了甲酸与三乙胺（5:2）作为氢源用于钌催化的不对称转移氢化反应，此后该体系在多种应用中得到使用。鉴于氘气的成本，实验室制备D?的方法已被开发，如Himeda等人开发的通过铱催化剂在D?O中脱氢甲酸制备氘气，并将其应用于转移氘代反应。
对于放射化学家而言，使用氘气的HIE实验反应优化是一个耗时的过程。若能建立可同时测试不同反应条件的装置，将节省大量时间和精力。高通量化学可能为加速反应优化提供途径，但在平行合成实验中使用氘气因实际操作考虑而受到限制：处理易燃气体、缩短管线以减少昂贵试剂损耗、以及需要专用设备将氘气钢瓶与HTE孔板连接等。传统上，氘气HIE反应使用氘气歧管、D?填充气球或带有D?氛围的小型旋转反应器进行；Skrydstrup及其同事还报道了两室反应器用于从重水中原位制备氘气。这些方法的缺点在于设置多个反应缓慢且繁琐。
因此，研究人员寻求在HTE格式中使用氘气进行铱催化HIE的方法。2001年Wilkinson及其同事报道了在80孔HTE装置中使用氘气，但指出反应小瓶之间无隔板，这对挥发性底物或筛选不同挥发性溶剂构成限制。Phillips及其同事采用类似装置优化脱卤氘代程序，并报道了使用Python的自动化同位素掺入计算。Chirik及其同事则通过加压96孔板使用H?的专用装置。由于研究人员所在机构缺乏向HTE输送D?的专用设备，因此探索了实际的替代方案。
**研究开展与核心贡献**
本研究展示甲酸-d?与三乙胺（5:2）混合物作为便捷的氘替代试剂，可用于HTE格式中的转移氘代HIE反应。该方法无需将HTE孔板与气体钢瓶连接，允许平行筛选多个反应，并为同位素化学家的端到端自动化铺平道路。
研究首先用氘代甲酸替代甲酸测试其在标准HIE条件下的表现。所用初始催化剂为cat1a（NHC-Ir催化剂家族成员），选择原因是该类NHC-Ir催化剂具有广泛的底物范围、良好的多溶剂溶解性和台式稳定性。使用cat1a与2-苯基吡啶在室温、40 °C、50 °C和60 °C下，以5当量和50当量甲酸-d?与三乙胺进行反应，所有条件均获得高水平氘掺入。
随后转移至96孔板格式，选用para-dox铝模块，因其可加热且密封以避免挥发性物质（包括溶剂和可能形成的D?）损失。2-苯基嘧啶和2-苯基吡啶在5–20 mol% cat1a负载量下显示高氘化水平，1 mol%时略有下降；苯甲酰胺在20 mol%负载量时部分氘代，较低负载量时几乎无掺入。手套箱惰性氛围组装与台面空气暴露组装的HTE孔板无差异，但为保证实验间可重复性，后续均在惰性氛围下制备。研究确认使用全氘代三乙胺-d??与非标记三乙胺对三个底物无差异，表明碱未发生交换。cat1a耗尽后，后续工作使用cat2进行，桥接研究表明cat2与cat1a对2-苯基吡啶给出相似结果。
**底物范围考察——48种不同底物**
为评估方法的范围和可重复性，研究人员使用甲酸-d?/三乙胺（5:2）混合物与20 mol% cat2对48种底物（重复）进行测试。为便于数据解读，编写了Python脚本，从原始数据中提取目标分子的质量分布，并使用IsoPat2算法确定同位素分布，可轻松比较正负离子模式以确保数据稳健性。
结果显示，含芳香sp2氮的导向基团表现良好（约0.73–2.44
2H/分子掺入）；吡啶/嘧啶-吲哚组合获得较低掺入。需注意条件相对温和，仅使用20 mol% cat2和5当量氘源，而优化氚标记反应的条件常使用化学计量催化剂和大量过量氘气。三唑、四唑和酰胺未获得掺入，其中四唑导向基团在所用条件下已知HIE效果差，Kerr等人已报道四唑的通用方法。
在多样结构亚组中，喹啉N-氧化物和二苯甲酮亚胺反应良好；而含胺、磺酰胺、醛、甲氧基苯甲酰胺、羧酸、氯/羟基、脲和氨基甲酸酯的芳香族化合物未显著掺入氘，亚砜和氧化膦也未掺入。五个底物因质谱电离困难无法分析，如需可改用其他分析技术。2-膦杂环戊烯氧化物化合物A7/B7部分反应生成氘代膦杂环戊烷，但膦杂环戊烯未显示氘掺入。由于重复之间观察到波动，化学实验至少需重复两次，阳性结果应使用标准D?歧管化学确认方法的适用性。
**抑制实验**
在确认预期导向基团可获得氘代化合物且Python脚本可确定掺入量后，研究人员考察其他官能团对HIE反应的影响。选择三个初次反应表现优异的底物：2-苯基吡啶（S-A）、3,5-二苯基-1H-吡唑（S-B）和喹啉N-氧化物（S-C），在竞争性底物CS1至CS16存在下评估HIE反应。底物和催化剂预先混合30分钟再加入氘代混合物，以允许潜在络合发生。由于混合物中有两种反应物而非一种，甲酸-d?与三乙胺当量从5增加至10。
多数化合物未强烈影响底物氘掺入，但有些降低了反应效率。CS1和CS7为芳基腈，已知是HIE抑制剂，对S-B和S-C的氘掺入有显著影响。三唑CS6也降低了S-B和S-C的氚掺入，而苯基四唑CS13完全抑制了S-A、S-B和S-C的氘掺入，表明四唑基团可能以非生产性方式结合铱催化剂使其失活。苯甲酸CS14降低了S-B的氘掺入，或许表明对酸量敏感。Python脚本对底物工作良好，但对部分竞争性底物效果不佳，电离差的底物产生误导结果，再次凸显选择适当分析技术的重要性。
**12种活性药物成分的HTE研究**
在证明方法对构建块的实用性并鉴定抑制性基序后，研究人员考察平台对更重度功能化药物分子的实用性。选择12种活性药物成分（D-1至D-12），其中一些先前已有氢同位素标记形式的报道。
反应在96孔板中进行，每个实验重复8次。除利莫那班（rimonabant, D-3）外，成功标记的活性药物成分经制备型HPLC纯化后通过1H-NMR详细分析氘掺入。所有化合物在各孔间结果相当相似，增强了方法的稳健性和可重复性信心。西地那非（sildenafil, D-6）因氘掺入水平低无法确定区域化学。氘代氯硝柳胺（[2H]niclosamide, D-7）、氘代奥拉帕利（[2H]olaparib, D-9）和氘代塞来昔布（[2H]celecoxib, D-12）的区域化学与先前报道一致；氘代米那普仑（[2H]minaprine, D-1）、氘代鲁玛卡托（[2H]lumacaftor, D-2）、氘代卡马替尼（[2H]capmatinib, D-4）、氘代阿塔鲁伦（[2H]ataluren, D-5）、氘代马兜铃酸I（[2H]aristolochic acid I, D-10）和氘代维莫德吉（[2H]vismodegib, D-11）的区域化学与预期一致。
D-7从初始LC-MS结果到制备型HPLC前分离再到最终分离，同位素掺入显著下降（从2.6降至1.9再降至1.6
2H/分子），硝基芳烃质子酸性此前已有描述。类似地，D-4和D-10经制备型HPLC分离后同位素掺入远低于LC-MS初始结果（1.25降至0.17，1.70降至0.85
2H/分子），研究人员推测这是分离纯化过程中氘标记与溶剂发生交换所致。同位素氢与溶剂在纯化、储存或生物测定期间的交换常被观察到。
需要特别指出的是，托美丁（tolmetin, D-8）的氘掺入后来证明即使无催化剂也能发生，可能因其烯醇化羧酸可与甲酸-d?反应使亚甲基氘代。这凸显了根据项目需要进行额外1H NMR分析或使用D?歧管进行HIE的重要性，因甲酸-d?可能导致"假阳性"HIE。
HIE反应为平衡过程，意味着使用近化学计量氘时无法实现高同位素富集。近年来虽有减少过量同位素氢使用的趋势，但几乎总使用多当量。该方法允许精确控制相对量，对更活泼底物可使用较少氘，反之亦然；若掺入不足，可轻松进行多次迭代反应，向孔中再加入氘代混合物重复反应即可提高氘掺入程度。
**HTE催化剂筛选**
最后，研究人员考察高通量氘代装置筛选适宜HIE条件的适用性。选择前述筛选中的鲁玛卡托（D-2）、西地那非（D-6）、托美丁（D-8）和塞来昔布（D-12），使用10种不同催化剂cat1b–cat10，部分额外添加碱，并筛选不同溶剂（2-甲基四氢呋喃、氯苯和N-甲基吡咯烷酮）。
每各化合物反应重复进行。对于D-2，铱催化剂cat1b、cat6、cat8和cat2显示前景，cat2表现最佳，其他催化剂HIE极少。额外添加三乙胺对cat2结果不一。对于D-12，总体交换差，与先前结果形成对比，研究人员认为酸性HIE介质干扰铱与吡唑氮的络合导致差异。cat2无论是否添加额外三乙胺均表现最佳，cat6也获得一定氘掺入。
西地那非的更广泛催化剂筛选未获得边际水平的氘掺入。托美丁则所有测试催化剂均获得优异的氘掺入，但这是检测假象，无催化剂时观察到类似掺入水平，可能通过羧酸可逆烯醇化实现；因此含烯醇化部分的底物如托美丁构成此方法局限。
催化剂筛选可能取决于催化剂产生氘气的能力，即LC-MS观察到的氘掺入依赖于两个不同的催化剂依赖反应：甲酸-d?脱氢产生D?气体，以及使用D?气体或甲酸-d?中氘进行芳烃HIE。Himeda已证明甲酸/甲酸-d?在D?O/H?O中的脱氢随金属不同产生显著产物差异：铱催化剂cat11主要形成D?（86%），而铑催化剂cat12主要形成HD（91%），且速率不同。因此，催化剂依赖性氘气生成与催化剂在HIE反应中的个体性能均可能对催化剂筛选结果负责。
**讨论与结论总结**
需要认识到，使用甲酸-d?/Et?N（5:2）不等同于使用D?气体，且氚标记甲酸因比活度限制不适用于常规高比活度反应。因此，HTE筛选获得的任何催化剂用于T?气体氚标记应用前，需额外验证其适用性。
本研究展示了基于转移氘代的高通量氢同位素交换，采用甲酸-d?作为难以引入96孔板的D?氛围的替代试剂。该平台实现了不同底物和反应条件的快速筛选，此前需单独设置。温和条件、简便的实验设置（储备溶液、环境氛围可能性、无需专用设备）使其成为筛选多种氘代反应和条件的吸引性方法。氘代试剂（甲酸-d?）当量可精细调节以提供温和或更强制条件，最终反应分析的端到端自动化（将原始LC-MS数据转换为氘掺入量）对评估同位素掺入具有实用价值。
**研究结论翻译**
研究人员已展示基于转移氘代的高通量氢同位素交换。在此，研究人员采用甲酸-d?作为D?氛围的替代试剂，否则难以在没有专用设备的情况下将D?引入96孔板。该平台使研究人员能够快速筛选不同底物和反应条件，而这些此前必须单独设置。温和的条件和简便的反应设置——使用储备溶液、可在环境氛围下进行、无需专用设备——使该方法成为筛选多种氘代反应和反应条件的吸引性途径。氘代试剂（甲酸-d?）的当量可精细调节，根据具体底物提供较温和或更强制条件。最后，反应分析的端到端自动化（将原始LC-MS数据转化为氘掺入量）对评估同位素掺入非常有用。
