《RSC Chemical Biology》：Peptides as programmable molecular scaffolds: from chemical synthesis and engineering to translational medicine
肽已从天然配体与经典激素发展为一类多功能且可工程化的功能分子。本综述全面概述了支撑可编程肽工程的全流程技术进展。研究人员首先讨论了自动化流动合成、化学选择性连接、非经典残基引入、主链编辑、构象约束及后期官能化等创新方法，这些技术已将肽化学从线性序列组装转变为模块化工程支架。随后，研究人员审视了现代发现策略，包括噬菌体展示、结合RaPID系统的mRNA展示，以及计算与人工智能驱动的设计策略，这些方法加速了苗头化合物识别与多参数优化。生物物理表征技术、细胞靶点占据实验及新兴递送策略也被作为衔接生化活性与胞内作用的关键工具予以评述。最后，研究人员探讨了肽类治疗药物的转化壁垒及已推动多个临床成功应用的工程策略。上述进展共同标志着一个新时代的到来：肽不再被视为生理条件下固有不稳定的生物分子，而是成为一类结构功能可被精准设计的化学可编程支架。
引言
肽已成为化学与生物学交叉领域极具吸引力的分子模式，其近期突破广泛覆盖生物药物发现、医学诊断与治疗开发等领域。肽介于小分子与大分子之间，兼具多重独特优势：相较于小分子，肽能更有效地结合面积更大、更平坦或更动态的 biomolecular 界面，包括传统类药化合物难以调控的蛋白质-蛋白质相互作用界面；相较于抗体与其他蛋白类药物，肽分子量显著更小、合成可及性更高，通常更易开展基于序列与结构的优化，同时仍保持高靶点特异性与强分子识别能力。因此，肽正日益被视为一类多功能且可工程化的功能工具，而非仅介于现有模式之间的中间体。
尽管具备上述优势，肽类长期受限于一系列公认的开发短板：由天然氨基酸构成的肽尤其是线性肽，或仅经少量修饰的肽，常面临快速蛋白酶解、血浆半衰期短、膜通透性差与口服生物利用度低等问题，这使其传统上多局限于注射给药，且靶点选择偏向细胞外。早期肽发现与优化管线也相对局限，高度依赖内源性配体序列与结构、经典药物化学优化或通量较低的筛选范式。同时，肽生产长期面临溶剂消耗大、纯化难度高与工艺强度大的实际负担，凸显该领域的限制不仅来自生物学层面，也来自合成与操作层面。
近年技术发展已显著改变了这一局面。合成化学与生产工艺的进步让越来越复杂的肽结构变得可及，现代肽工程与化学方法学工具让研究人员能够更有针对性地调控稳定性、亲和力、构象、通透性与药理行为。这些进展涵盖自动化快速流动合成、环状支架高效制备、非经典构建单元广泛应用、肽钉合与大环化策略，以及从序列组装到可编程分子工程的理念转变。
与此同时，通过衔接化学、筛选与计算的创新，肽的可及化学与功能空间持续拓展。随机非标准肽发现策略，包括RNA/mRNA展示与噬菌体展示平台，极大拓宽了可及生物活性配体的多样性，尤其在大环肽领域，同时支持下游亲和力成熟与化学剪裁修饰。近期，人工智能与深度学习驱动的大环设计已初步证明，可通过数据驱动与结构引导的方法以更高精度生成肽结合剂，进一步加速从经验发现向预测性设计的转型。这些发展共同支持一种观点：肽科学不再仅围绕天然配体或经典肽类激素展开，而是正进入一个更广阔的“化学多元宇宙”，其中合成、发现与设计正不断走向成熟与精细化。
本综述聚焦贯穿肽上游至下游全流程的技术进展，而非针对特定靶点的单一成果。核心观点是，肽化学与生物学已进入新的机遇期，现代使能技术正逐步将肽从生理条件下固有不稳定的生物分子，转化为稳定、可编程、可优化且可转化的分子平台。研究人员围绕驱动这一转型的工具与策略展开论述，涵盖肽合成与化学工程、发现与药物优化、生物物理表征、细胞靶点占据，以及下游后期转化开发。通过强调这些相互关联的进展，旨在不仅呈现领域现状，也阐明新兴技术如何重塑肽科学在发现与应用层面的未来轨迹。重要的是，这些进展并非独立发展，而是相互强化的创新，共同提升了肽的发现效率、合成与化学修饰能力、性能表现及转化可行性。
肽合成与化学工程进展
现代肽化学的定义已不再局限于线性氨基酸序列的高效组装，而是日益侧重肽结构、稳定性与功能的可编程工程化。这一转变至关重要，因为线性肽虽可通过固相合成与自动化合成快速获得，但仍常受限于构象柔性、生物半衰期短与开发潜力不足。快速合成提供了必要起点，但无法单独将肽序列转化为稳定的生物探针或治疗候选物。本节按工作流程组织近期进展：从快速获取线性肽支架出发，依次推进至构象控制、会聚式组装、构建单元拓展与后期功能多样化。
早期肽科学中，合成工作常集中于克服序列延伸、偶联效率与纯化方面的实际限制。该领域的首个突破可追溯至1963年Merrifield设计并成功利用固相肽合成(solid-phase peptide synthesis, SPPS)合成缓激肽。此后，天然氨基酸线性肽的合成速度大幅提升，近年许多自动化肽合成仪甚至可在两小时内完成20聚肽的合成。这一原理实现了线性肽的高效制备，后续推动了自动化肽合成的发展，可快速制备类似物用于序列-活性关系研究、代谢稳定性评估与药物化学优化。在药物发现领域，这种快速生成大量相关序列的能力尤为重要，它为下游系统工程师提供了所需的上游原料。其中，基于流动的SPPS是传统与自动化SPPS的重要延伸，相较于批次合成，其在试剂输送、混合、温度控制、循环时间与重现性方面均具优势，特别适用于困难序列、快速类似物制备与优化项目。
然而，快速获取线性肽前体仅是肽工程的第一步，许多线性肽因游离末端与溶剂暴露的酰胺键仍存在构象柔性与代谢不稳定性。首尾环化是解决这些局限的经典策略之一，通过去除末端降解位点并将肽主链约束为闭合拓扑结构，可提升蛋白酶抗性、降低构象熵并在有利情况下增强靶点识别。近期可实现首尾环肽制备的自动化流动方法，成为快速前体合成与拓扑驱动的支架工程之间的重要桥梁，能以更高效率从线性前体制备约束肽架构。除首尾环化外，更广泛的大环化与钉合策略拓展了肽构象的控制方式：侧链-侧链环化、二硫键形成、硫醚键形成、联芳基连接与烃钉合分别施加不同的几何约束与化学性质。这些方法可降低构象熵、稳定生物活性构象、增强蛋白酶抗性，并在部分案例中提升细胞通透性或胞内活性。例如，烃钉合被广泛用于稳定靶向蛋白质-蛋白质相互作用的α-螺旋肽，而新型化学选择性钉合方法允许在未保护或最低程度保护的肽上以更温和的条件实现构象约束。但构象约束并非普遍有益：若施加的几何结构与结合构象不匹配，环化或钉合反而会降低活性，且稳定性提升并不必然带来通透性改善或体内暴露量增加。因此，这些策略需与结构、生物物理与细胞评估结果结合使用，而非被视为解决肽类缺陷的通用方案。
与直接解决构象与稳定性局限的环化及钉合并行，化学选择性连接策略解决了另一难题：通过直接链延伸获取长链、易聚集或结构复杂的肽的难度。传统SPPS随序列长度增加会变得愈发困难，不完全偶联、缺失产物、聚集与纯化问题会不断累积。化学选择性连接提供了会聚式解决方案，允许分别合成较短肽片段，再通过选择性成键反应进行连接。天然化学连接(native chemical ligation, NCL)仍是基础范例，可使肽硫酯与含N端半胱氨酸的片段在水相条件下反应形成天然酰胺键。近期进展包括增强型NCL条件与基于α-酮酸-羟胺(α-ketoacid–hydroxylamine, KAHA)的连接策略，拓展了片段偶联的可行性，并实现了对困难肽与类蛋白靶点的获取。连接的概念重要性在于将肽合成从严格线性过程转变为模块化组装策略。与环化或钉合不同，连接本身不一定提升代谢稳定性或构象控制能力，而是拓展了可构建的分子类型，包括更长肽、分段修饰构建体、环状或分支架构，以及难以通过直接SPPS获得的多种功能肽偶联物。水相容连接与原位肽环化方法进一步展示了会聚式组装如何与拓扑控制相结合。同时，连接方法也存在重要局限，包括序列依赖性反应性、连接位点要求、官能团兼容性与保护基考量。这些权衡使得不同连接策略的直接比较尤为重要。总体而言，连接通过提升肽结构的可及尺寸、模块化与架构复杂性，补充了聚焦拓扑的方法。
与合成和组装进展并行，肽化学家日益将肽的组成拓展至20种经典氨基酸之外。非经典氨基酸、D-氨基酸、N-甲基化残基、β-氨基酸、氮杂肽基序、脱氧肽键、类肽结构与其他主链修饰提供了仅通过天然序列变异无法实现的性质调控手段。这些修饰可提升蛋白酶稳定性、改变氢键模式、调节构象偏好、提高靶点亲和力、引入反应手柄，并调整与通透性和溶解度相关的理化性质。主链编辑进一步拓展了这一概念，通过改变肽主链本身的连接性与化学属性实现调控。近期如翻译后O-到N-酰基转移化学的策略表明，肽类分子可在初始组装后进行多样化衍生，生成主链嵌入基序与含杂环的架构。但非经典残基或主链修饰也可能降低结合亲和力、破坏二级结构、增加合成复杂度或引入新的开发挑战。其价值在于实现系统性的性质调控，而非提供解决肽类局限的通用方案。
后期官能化为肽工程提供了最后一层工具箱拓展。非经典残基与主链修饰通常在序列组装过程中引入，而后期官能化允许在合成完成后对高级肽支架进行多样化衍生。这在策略上具有重要价值：优化后的肽序列或约束支架无需为引入新官能团而从头重建，而是可利用位点选择性或残基选择性化学，直接在已制备的肽上安装荧光基团、亲和标签、成像基团、递送基序、生物正交手柄、连接子或载荷。近期案例包括色氨酸选择性官能化以实现四嗪兼容的生物正交连接、苯丙氨酸肽的钯催化修饰、硒代半胱氨酸的光催化官能化，以及利用多功能试剂实现的半胱氨酸选择性双官能化。其他方法将大环化与官能团安装相结合，展示了结构约束与功能多样化可在单一合成策略中实现整合。但后期修饰也可能改变结合能力、溶解度、聚集行为、通透性或代谢稳定性，且对于较长或高度官能化的肽，位点选择性、反应兼容性与纯化可能成为实际挑战。
综上，这些进展定义了现代肽化学的连贯发展路径：SPPS与流动合成实现线性肽支架的快速获取；环化与钉合解决构象柔性与蛋白酶敏感性问题；连接拓展了可及架构的尺寸与模块化程度；非经典残基与主链编辑拓宽了用于性质优化的化学空间并提升固有稳定性；后期官能化则可将高级支架转化为探针、偶联物或治疗候选物。当前的核心挑战已不再是能否合成某一肽序列，而是能以多高效率将该序列转化为稳定、功能完备且可开发的分子支架。
肽发现、药物优化与实验指导设计
二十世纪的大部分时间里，治疗性肽主要通过理性设计发现——模拟内源性配体或截短天然激素，典型案例如催产素的系统修饰最终得到卡贝缩宫素（carbetocin，用于减少产后大出血），以及对天然胰高血糖素样肽-1的迭代结构优化得到用于治疗2型糖尿病的司美格鲁肽。肽药物发现的转型兼具概念与技术层面：现代基于文库的筛选平台可在单次实验中筛选10?–1013个序列，化学生物学将可及序列空间拓展至20种经典氨基酸之外，计算与人工智能工具正在加速管线的每一个环节。核心问题已从“我们应设计哪种序列？”转变为“哪种平台能最高效地揭示最优序列？”。瓶颈不再是产生肽多样性，而是识别并优化最具转化潜力的多样性。为明确各类方法的定位，代表性肽发现与优化策略的核心原理、主要优势、关键局限与典型用途可归纳如下：理性设计基于已知配体或底物，优势是机制清晰、可进行聚焦优化，局限是依赖先验知识、普适性差，典型应用于内源性肽激素优化与底物启发的大环抑制剂；噬菌体展示基于噬菌体展示文库与迭代淘选，优势是筛选稳健、文库规模大、可获得约束支架，局限是存在遗传编码偏倚与展示格式效应、靶点固定化可能产生假象，典型应用于肽结合剂与双环肽支架发现；mRNA展示/RaPID系统基于mRNA连接的肽与遗传密码重编程，优势是文库规模极大、可直接测序、可及大环结构，局限是需要专业技术、存在筛选偏倚、仍需后续优化，典型应用于KRAS靶向大环肽苗头化合物发现；苗头到先导优化基于丙氨酸扫描、主链修饰与大环化，优势是可提升稳定性、效力与选择性、实现多参数调控，局限是存在性质权衡、需反复合成与测试，典型应用于大环肽抑制剂与肽苗头化合物的ADME性质优化；实验指导设计基于结合实验、细胞实验与靶点占据实验，优势是结果正交验证、具备细胞相关性、避免仅以亲和力为导向的优化，局限是存在实验假象、受通透性屏障影响、结果具有情境依赖性，典型应用于SPR/BLI/ITC结合检测、细胞活性检测与CETSA胞内靶点占据检测；计算与人工智能驱动设计基于结构预测、生成模型、序列设计与闭环学习，优势是可加快优先级排序、探索大设计空间、实现合成前筛选，局限是仍需实验验证、依赖模型与数据质量、基于结构假设，典型应用于AlphaFold/RFdiffusion/CycleDesigner指导的肽结合剂发现。
从理性设计到基于文库的肽发现
尽管领域整体转向基于文库的发现，理性设计在特定案例中仍取得了显著成功。典型代表是基于病毒蛋白酶天然底物通过理性设计开发丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶大环抑制剂，利用大环化刚性化肽支架，最终获批了帕利瑞韦(paritaprevir)、格拉瑞韦(grazoprevir)、伏西瑞韦(voxilaprevir)与格卡瑞韦(glecaprevir)等多个药物。但该成功主要局限于此类靶点，凸显了理性大环设计普适化的挑战，也推动了向基于文库发现平台的转型。与理性设计相比，基于文库发现的认识论优势在于：筛选平台并非探索研究者的假设空间，而是利用靶点本身通过直接竞争结合识别有效序列，常能发现包含非常规残基组合与主链修饰的活性序列，这是任何假设驱动的方法都无法生成的。两类平台技术推动了这一转型，各自可及不同的化学与结构空间。
噬菌体展示将10?–101?个序列的肽文库呈现在噬菌体衣壳蛋白上，通过对固定化靶点进行迭代亲和淘选，再结合二代测序鉴定富集的结合剂。Heinis团队通过用三(溴甲基)苯(tris-(bromomethyl)benzene, TBMB)交联展示肽，生成了具有优异蛋白酶抗性与结合表面互补性的约束双环支架。该方法发现了BT8009（Bicycle Therapeutics公司），一种靶向Nectin-4的双环肽-毒素偶联物，目前已进入I/II期临床，后续经非经典氨基酸替换优化后，KD达到2.5 nM并实现高度靶点选择性。
mRNA展示与RaPID系统将文库规模拓展至1013个独特序列，每个肽与其编码mRNA共价连接，无需去卷积即可通过测序直接鉴定苗头化合物。RaPID（随机非标准肽集成发现）系统将mRNA展示与遗传密码重编程整合：工程化flexizyme（柔性tRNA氨酰化核酶）将非N-甲基化、D-构型与β-氨基酸加载到转运RNA(transfer RNA, tRNA)上用于核糖体掺入，同时氯乙酰起始子可与下游半胱氨酸自发发生大环化——意味着每个文库成员在进入筛选前就已是一个类药大环肽。LUNA18项目完整展示了从发现到临床的路径：针对KRASG12D的RaPID筛选得到苗头化合物AP8747；丙氨酸扫描绘制药效团；迭代非经典氨基酸替换得到细胞IC??为1.4 nM（AsPC-1细胞）且口服生物利用度为21–47%的11聚环肽，目前已进入I期临床。
肽药物化学中的苗头到先导优化
文库筛选得到的苗头化合物具有一定亲和力，但药物样性质不足。丙氨酸扫描用于绘制药效团：替换后自由能变化大于2 kcal mol?1的位置是需保留的关键接触位点；允许替换的位置则可作为ADME调控位点。代谢稳定性可通过主链N-甲基化（消除氢键供体并从空间位阻上阻断蛋白酶活性位点）、在蛋白酶敏感位置引入D-氨基酸以及大环化去除游离末端等方式提升，可将血浆半衰期从数分钟延长至数小时。其他局部主链修饰包括立体化学反转、原子替换（如氮杂肽或脱氧肽）、侧链从α-碳原子移至酰胺氮原子的类肽结构，或β-氨基酸主链延伸，均可进一步拓展结构多样性并改善药物样性质。细胞通透性通过将cLogP调控在2–5窗口并利用构象“变色龙”行为进行优化，即极性NH基团在膜相容构象中被埋藏，而在水环境中暴露。多参数优化(multi-parameter optimization, MPO)同步追踪效力、选择性、稳定性与通透性。相关研究已在免疫检查点靶点上验证了这一逻辑：基于结构的约束环肽设计得到TIM-3抑制剂，经SPR与细胞实验验证；第二代环LAG-3抑制剂通过系统主链修饰与生物物理表征优化，提升了效力与选择性。
实验指导的迭代设计
苗头到先导优化是一个自我纠错的反馈循环，每一轮的生物数据直接决定下一轮的合成方向。一级生化实验包括SPR、BLI与ITC，用于测量结合亲和力与动力学参数，快速对类似物系列进行排序。二级细胞实验验证细胞活性：若失败则引导化学工作转向通透性优化或外排调控，而非继续提升亲和力。三级机制实验特别是细胞热位移实验(cellular thermal shift assay, CETSA)，用于确认完整细胞内的直接靶点占据。这一分层框架已广泛应用于肽药物发现：靶向蛋白质-蛋白质相互作用的环肽抑制剂，如ICOS/ICOSL与CD28，通过正交生物物理与细胞实验指导的迭代合成进行优化，实现了高效力与高选择性。
计算与人工智能驱动的肽发现
计算工具通过加速序列生成、优先级排序与优化，对实验检测形成补充。AlphaFold3可预测肽-蛋白质复合物结构（含非经典残基），在合成前提供结合假说。RFdiffusion（RFdiffusion扩展版）可生成具有皮摩尔级亲和力的从头肽结合剂，而CycleDesigner结合CyclicMPNN序列优化、RFdiffusion生成的大环支架与先进结构预测，可得到折叠准确（RMSD < 1.5 ?）并经实验验证的环肽。人工智能与机器学习模型进一步指导序列优先级排序与优化：基于SAR数据训练的模型可减少约十倍合成负担，自由能微扰(free energy perturbation, FEP)计算可定量预筛残基替换。计算流程已成功设计出靶向TREM2与SLIT2/ROBO1的大环抑制剂，证明肽类方法优于小分子的场景。AI指导设计的靶向免疫检查点受体CD28的环肽CIP-3，凸显了计算方法生成T细胞共刺激功能肽调节剂的潜力。预测-合成-测试-重训练的闭环循环可将发现周期从数年压缩至数月，凸显现代肽药物发现的瓶颈已不再是产生多样性，而是高效识别并优化最具转化潜力的序列。
肽-靶点相互作用的生物物理筛选与机制表征
肽结合的生物物理表征挑战
肽的生物物理表征面临多重实验挑战，源于许多肽固有的理化性质。肽通常具有柔性与高电荷特征，这使确定明确构象与结合模式变得复杂。此外，许多肽具有表面活性，易导致非特异性吸附到实验表面（如毛细管壁与孔板），并产生实验假象。同时，肽还常发生弱且瞬时的相互作用，导致低亲和力结合，难以用标准技术检测或定量。进一步，潜在的不稳定性（包括对聚集、降解或构象变化的易感性）会使可重复测量与结合数据解读更加复杂。这些因素共同使得肽-靶点相互作用的严格生物物理分析要求极高，需要对相互作用进行充分的正交验证。
结合亲和力与动力学
测定结合亲和力的常用方法包括表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)、生物膜干涉(biolayer interferometry, BLI)、微量热泳(microscale thermophoresis, MST)与光谱位移(spectral shift, SpS)等。SPR与BLI特别适合测定动力学参数（如kon、koff与驻留时间），而MST与SpS可实现结合的快速评估。等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry, ITC)可提供额外热力学信息，如结合焓、熵以及相互作用的化学计量比。但由于靶点与肽之间可能存在弱相互作用，单独使用这些方法进行表征具有挑战性，因此联合多种技术是成功表征肽结合的关键。
现有与新兴的高通量生物物理方法
高通量筛选(high-throughput screening, HTS)平台的建立需要稳健且可拓展的筛选方法，以处理大规模肽文库。经典方法是溶液相HTS实验，如荧光偏振(fluorescence polarization, FP)或基于FRET的实验（TR-FRET、AlphaScreen）。FRET或AlphaScreen实验在肽与靶蛋白发生相互作用时产生邻近依赖信号，可拓展至384孔或1536孔板，且因检测灵敏度高而结果稳健。例如，Wilson团队描述了一种利用AlphaScreen技术筛选破坏OX40受体与其配体相互作用的小肽的方法。基于微阵列的平台（如pHLA微阵列）利用固体表面（如微腔芯片）固定数千种肽，再用靶蛋白进行探测，通过荧光或无标记成像检测结合。肽微阵列在T细胞受体(T cell receptor, TCR)–pHLA筛选中尤为有用，Kramer团队利用微腔芯片构建了超高通量平台存储肽文库，加入生物素化HLA激活文库，结合处形成稳定复合物并转移至链霉亲和素(streptavidin, SA)包被的底物，随后可通过优选方法（如highSCORE评估TCR结合）进行分析。基于质谱的平台如配体足迹质谱(ligand-footprinting mass spectrometry, LiF-MS)与亲和选择质谱(affinity-selection mass spectrometry, AS-MS)是高通量环境下鉴定结合肽的有效方法。通过联合多种技术，AS-MS展示了这种交互式方法如何改进结果。例如，Zhang团队开发了BLI作为初筛方法捕获结合剂，再通过串联质谱洗脱与测序的工作流程，该技术可实现大规模文库筛选，具备实时监测、低背景信号与高特异性的特点。
结合位点绘图
核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)光谱是绘制肽-蛋白质相互作用结合位点的有力工具，尤其适用于柔性配体与弱复合物。在典型实验中，对同位素标记的蛋白（如1?N）滴定肽，并在二维谱（如HSQC）中监测化学位移扰动。肽加入后发生显著位移的残基可指示结合界面所在区域或其附近。由于NMR提供残基水平的信息，它不仅能精确定位相互作用表面，还可提供结合亲和力与交换动力学的线索。其主要局限是蛋白NMR实验的样品与时间消耗较高。但已有研究致力于通过微流控二维NMR实现结合表征的全自动化，使该技术更适用于高通量筛选。另一种结合位点绘图方法是配体足迹质谱(LiF-MS)。该技术通过将光活化、可切割的交联剂系于肽配体，在结合过程中瞬时与邻近蛋白残基交联。切割后，微小共价标记保留在蛋白上，并通过串联质谱鉴定，提供定义配体在蛋白表面足迹的空间约束信息。
肽验证的正交工作流程
肽药物发现的典型工作流程始于通过MST/SpS或BLI/SPR等技术进行单剂量（中等或高通量）结合验证，再进行剂量-效应实验。一旦结合得到确认，进一步的生物物理研究（如BLI、SPR等）应表征结合动力学，并在可能的情况下通过ITC等手段测定热力学参数。最后，通过NMR或MS进行结合位点绘图，可提供结合界面的位置与性质的额外信息。对于肽苗头化合物，联合正交生物物理方法不可或缺。只有通过这些互补方法可靠地定义结合机制，才能为下游转化提供支持。
肽生物学与胞内靶点占据的细胞技术
为何生化效力不足
在生物物理实验中以纳摩尔级亲和力结合靶点的肽，可能在细胞中无法产生生物学响应。肽面临一系列小分子基本不存在的屏障，包括被动膜通透性差、在内体区室滞留以及快速蛋白酶解。靶向MDM2–p53的钉合肽就是这种脱节的典型案例：早期苗头化合物与MDM2结合力强，但几乎未观察到细胞p53激活，主要原因是它们无法以有效浓度进入胞质。这些失败推动了细胞技术的发展，以解决生化数据无法回答的三个问题：肽是否在细胞内结合靶点、能否克服递送与稳定性屏障到达正确区室、这种占据最终是否产生生理结局。
测量胞内肽-靶点结合
胞内肽治疗药物的首要要求是证明其能在细胞环境中物理结合靶点。细胞热位移实验(CETSA)通过测量配体诱导的蛋白在完整细胞内的热稳定性变化来检测这种占据。当肽结合靶点时，复合物可抵抗热变性，产生可测量的聚集温度变化。Verma团队将CETSA直接应用于肽药物发现，证实钉合肽在胞内同时结合MDM2与MDM4，并比较了不同类似物的摄取与结合效率。该实验已从Western blot检测发展为SplitLuc CETSA（利用HiBiT标签实现1536孔板的发光读数）与实时CETSA(real-time CETSA, RT-CETSA)，可从单个样品获取完整熔解曲线。NanoBRET靶点占据实验提供了一种互补方法，利用NanoLuc标签靶点与细胞通透荧光示踪剂之间的能量转移，定量胞内亲和力与驻留时间，已开始应用于细胞通透约束肽。然而，即使结合得到确认，关键问题仍然存在：肽是高效到达胞质，还是有限的递送限制了观察到的占据？
评估与克服肽递送与稳定性屏障
肽可能在透化细胞中显示靶点占据，却在完整细胞中失败，仅仅是因为它从未进入胞质。氯烷穿透实验(chloroalkane penetration assay, CAPA)定量区室特异性的胞质进入能力：表达胞质HaloTag的细胞与氯烷标记肽发生共价反应，通过流式细胞术测量残留HaloTag标记得到CP50值，可区分真正的胞质递送与内体滞留。CAPA已被用于分析钉合肽、环细胞穿透肽与微型蛋白，并拓展至比较多种人类细胞系的穿透能力，揭示了细胞类型依赖的摄取效率。NanoClick实验提供了一种互补的高通量形式，将细胞内点击化学与NanoBRET检测结合，在96孔与384孔板中测量叠氮功能化大环肽的累积胞质暴露量。
除测量外，多种策略可直接解决递送屏障。源自病毒序列的细胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)，最著名的是HIV-1的TAT肽与果蝇Antennapedia的penetratin，已被广泛偶联至肽载荷以增强细胞摄取。但CAPA等定量实验显示，CPP递送的物质中有相当比例仍滞留于内体，胞质进入效率常低于总摄取提示的水平。对于即使偶联CPP仍不通透的肽，微流控机械穿孔平台如DμVS可瞬时通透细胞膜，实现直接胞质递送，并可结合功能实验区分穿透与占据。在递送确认与结合确立后，最终问题是占据是否转化为生物学结局。
评估胞内靶点的功能调控
肽候选药物的最终验证是证明其能在活细胞内调控靶蛋白功能。转录报告实验提供了下游生物学后果的直接读数。例如，p53报告细胞系可证实钉合肽介导的MDM2复合物解离能重新激活p53依赖的转录。膜破坏（LDH释放）与荧光素酶干扰的反向筛选仍必不可少，以区分真正的靶点调控与两亲性或阳离子肽可能产生的脱靶细胞毒性。为超越下游读数并直接监测蛋白质-蛋白质相互作用本身，NanoBiT（NanoLuc Binary Technology）将NanoLuc拆分为LgBiT与SmBiT亚基，仅当融合伙伴蛋白相互作用时才重组为发光信号。肽介导的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)破坏会熄灭该信号，实现对胞内PPI抑制的定量监测。已利用该方法在细胞内证实钉合肽可解离p53-MDM2与KRAS-效应物复合物。近期开发了针对NOS1–NOS1AP相互作用的NanoBiT高通量筛选平台，该PPI与心血管及神经精神疾病相关。稳定表达NOS1-HiBiT与NOS1AP-LgBiT融合蛋白的CHO-K1细胞系实现了超过240倍的信噪比，并利用肽抑制剂TAT-GESV完成了验证。对10?240个化合物的试点筛选鉴定出19个验证苗头化合物，IC??低至2.54 μM。重要的是，该平台架构——携带工程化拆分荧光素酶PPI报告基因的稳定细胞系——可轻松适配其他胞内PPI靶点，为小分子与肽药物发现提供了通用筛选框架。
肽作为胞内生物学工具
当递送、靶点占据与功能调控得到严格确立后，肽便成为探究胞内生物学独具精度的工具。钉合肽已阐明MDM2与MDMX对p53调控的相对贡献，而细胞通透环肽已作为探针用于破坏KRAS纳米簇集与下游致癌信号传导。结合结合实验、递送评估与功能报告的一体化工作流，正将肽从有前景的生化结合剂转化为经生物学验证的制剂。随着这些细胞技术日趋成熟，它们将日益定义靶向胞内蛋白质-蛋白质相互作用的肽类治疗药物的转化路径。
从细胞活性到转化：推进肽类治疗向临床应用
肽已成为一类极具吸引力的治疗分子，因其兼具高特异性与灵活设计能力。过去二十年在肽鉴定与筛选技术上的进展，使研究人员发现了大量在生化与细胞实验中均表现良好活性的潜在肽类药物。然而，将这些潜在药物转化为临床有效疗法已被证明十分困难。许多在体外效力优异的肽无法推进至临床前或临床开发阶段，因为它们无法承受临床前测试的考验，原因包括半衰期短、体内清除快、药代动力学特征差以及递送障碍。因此，克服这些挑战已成为肽类治疗开发的核心议题。本节讨论的主要转化壁垒与代表性工程策略可归纳如下：主要挑战包括蛋白酶快速降解导致生物体液中的肽稳定性下降、肽分子量小导致的快速肾清除，以及膜通透性屏障引起的细胞或组织递送受限。为克服这些局限，已开发多种工程策略：环化或烃钉合等结构稳定方法可增强构象稳定性与蛋白酶抗性；PEG化或脂质化等药代动力学优化策略可增加分子尺寸并促进与血清蛋白的相互作用，从而延长循环时间；此外，纳米颗粒递送系统可提升肽稳定性并助力靶向递送。这些进展共同推动肽候选物成功转化为临床获批疗法，如用于治疗代谢性疾病的胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)类似物。
转化的药代动力学与药效学屏障
肽转化的主要挑战之一是酶解导致的不稳定性。由于肽天然存在于体内，它们极易被蛋白酶降解，导致体内半衰期极短。为克服这一问题，已开发多种化学策略提升肽稳定性。环化是通过限制肽的柔性并改变其结构以屏蔽蛋白酶切割位点的常用稳定化方法。另一种技术是烃钉合，被用于稳定α-螺旋肽以增强其蛋白酶切割抗性并提升靶点结合能力。其他用于增强肽抗蛋白酶解稳定性的方法还包括使用D-氨基酸或N-甲基化氨基酸，这些方法不仅提供降解保护，还能保留生物活性。
药代动力学局限是肽类治疗的第二大挑战。肽的小分子量导致快速（肾）清除，使系统暴露时间极短。因此，研究人员开发了多种化学策略修饰肽以延长循环半衰期。最常用的化学修饰方法是PEG化，即将聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)共价连接到肽上以增加其流体力学尺寸（从而降低肾清除率）。另一种被广泛接受的延长肽半衰期的修饰方法是通过脂质化，依靠肽与血清白蛋白的可逆相互作用延长循环时间并改善药代动力学(PK)特征。此外，部分肽还设计了白蛋白结合基序，进一步提升系统稳定性与持久性。
递送是肽类药物的第三大关键障碍，尤其当靶蛋白位于细胞内时。虽然肽可轻易结合并作用于细胞外蛋白受体，但进入细胞要困难得多，因为质膜对大多数肽不通透。细胞穿透肽(CPPs)已被探索作为促进肽类药物细胞摄取的潜在递送载体。此外，纳米颗粒递送系统正被开发为同时提升肽稳定性、靶向递送及其胞内递送的潜在解决方案。脂质纳米颗粒、聚合物载体与其他纳米材料可保护肽免于降解，同时实现在目标作用部位的控释。
为成功将肽类治疗转化至临床，严格的临床前评估至关重要。动物研究是评估肽药物药理学的重要工具，包括肽的药代动力学、生物分布与药效学特征。这些研究有助于确定肽是否能以药理相关（治疗）浓度递送至靶作用部位，以及肽是否具有可接受的安全性特征。肽药物的毒性与免疫原性也需仔细评估，因为重复使用肽药物有时会引发免疫反应。成像技术与分析工具的发展增强了评估肽体内分布与靶点占据的能力。
肽类治疗成功案例
尽管转化过程困难重重，许多肽类治疗已成功推进至临床应用。该类化合物成功的典型代表是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，目前已有多种GLP-1类似物获批用于治疗2型糖尿病与肥胖。GLP-1类似物包含化学修饰以提升稳定性并延长体内存留时间，从而维持体内效力。此外，肽工程与递送技术的进步也推动了肽类激素与受体激动剂的工程化与递送改进。
新兴技术将持续拓展肽类治疗的应用能力。计算建模与人工智能的进步正实现对具有最优结构与药理特征的肽序列的高效鉴定。新的治疗策略，如肽-药物偶联物与利用靶向降解方法调控难以成药的生物学靶点，正为开发临床相关肽类治疗提供更多机会，并支撑潜在细胞层面发现与实际肽类治疗之间的衔接。
总之，尽管仍存在显著障碍，但肽化学技术、递送系统与临床前验证方法的持续进步，正不断提升研究早期发现肽成功推进至临床研究的概率。随着这些领域的持续发展，肽类药物有望在当今药物发现领域占据日益重要的地位。
结论
肽化学与生物学的定义已不再主要围绕线性序列的高效制备或内源性配体的再发现。相反，该领域正日益围绕使能技术组织起来，这些技术支持以远更具可编程性的方式发现、工程化、验证与转化肽。贯穿本综述各节的一个一致主题是：当合成、发现、机制表征与转化设计不被视为独立阶段，而是作为一体化工作流时，进展最为显著。快速自动化合成缩短了从概念到分子的路径；展示技术、药物优化与计算设计拓展了可及结合剂的空间；正交生物物理与细胞实验使区分单纯生化效力与真正胞内靶点占据及治疗潜力成为可能。同时，近期在面向可开发性的化学方面的进展——包括代谢稳定性提升、半衰期延长与更复杂的递送策略——正帮助肽研究从“先结合、后修补”转向更早的多参数优化。
展望未来，肽科学的下一个重大进展很可能来自这些能力的更紧密耦合。未来的工作流将日益需要并行解决亲和力、通透性、稳定性、可制造性与体内暴露问题，而非按顺序优化。这将有利于形成闭环平台，其中合成、筛选、结构分析、AI引导设计与可开发性评估相互迭代提供信息。这种整合对于超越传统线性治疗剂的复杂肽尤为重要，包括高度约束的大环肽、口服可行的肽候选药物、靶向递送系统，以及用于诱导接近或靶向蛋白降解的肽类嵌合体。该领域还应持续从效力驱动的发现，拓展至情境感知的设计，其中组织进入、胞内运输、给药途径与作用机制被视为分子设计的固有组成部分，而非下游障碍。
更广泛地说，肽治疗的未来不仅取决于制备更好的结合剂，还取决于构建更完善的整套体系：在化学上可及、生物学上可信、临床上实用且可规模化生产的分子。从这个意义上说，肽科学的成熟不仅仅是产生更多肽候选物，而是将肽重新定义为一种多功能化学-生物平台，能够应对传统小分子或大型生物制剂难以触及的靶点与机制。如果当前分子工程、预测设计与转化技术的汇聚持续下去，肽将准备好在下一代谢学生物学与治疗发现中占据更核心的位置。
