前体基因工程扩展套索肽微菌素J25的环区

《RSC Chemical Biology》：Precursor gene engineering expands the loop region of the lasso peptide microcin J25

　　

微菌素J25（MccJ25）是套索肽家族的原型成员，其特征在于具有机械互锁结构。长期以来，科学家一直关注MccJ25，原因在于其具有强效的RNA聚合酶（RNA polymerase）抑制活性以及独特的穿线拓扑结构。以往通过前体工程构建MccJ25变体的研究，主要聚焦于氨基酸替换；然而，其中许多替换并不易被其生物合成机制耐受，并导致产量下降。本研究证明，MccJ25生物合成酶对环区中的插入具有出人意料的高耐受性。具体而言，环区可在不同位置扩展，最多可额外插入15个氨基酸，并且能够容纳多种类型的氨基酸。上述发现提示，套索肽合成酶（McjC）具有一个可耐受环区扩展的较大腔体。更广泛地看，本研究建立了一种构建机械互锁分子的新策略，并有望使多种生物活性配体嫁接到MccJ25支架上成为可能。

该研究发表于《RSC Chemical Biology》，聚焦于套索肽微菌素J25（MccJ25）的前体工程改造及其生物合成可塑性。MccJ25作为套索肽家族的代表性天然产物，具有由N端大环内酰胺环与穿线尾部共同构成的机械互锁拓扑，这种特殊结构赋予其较高的稳定性，并使其能够抑制细菌RNA聚合酶（RNA polymerase），从而阻断转录。尽管MccJ25的抑菌机制已得到较充分阐明，但其生物合成过程中前体肽如何被McjB与McjC加工为成熟套索拓扑产物，仍存在诸多未解问题。既往研究大多采用氨基酸替换策略改造前体肽McjA，以探查各位点对生物合成的影响，但大量替换会降低生物合成酶的识别与加工效率，导致产物产率下降。因此，如何在不显著破坏生物合成过程的前提下，对MccJ25骨架进行更大幅度、更多样化的结构扩展，成为该领域的重要问题。研究人员开展本项研究，正是为了探索“插入”而非“替换”这一前体工程路径，尤其考察MccJ25不同结构区域对额外氨基酸残基的耐受性，并评估其对套索拓扑形成与生物活性的影响。

研究人员首先基于套索肽的结构分区思想，将MccJ25划分为环区（ring）、环区上方的环套区即环区/袢区（loop）以及尾区（tail）。结合AlphaFold结构预测，研究提出McjC内部存在较深且较窄的腔体，其中与成环直接相关的区域可能受到更严格的空间与相互作用约束，而loop区域与酶接触较少，因此理论上更可能容纳结构延展。围绕这一设想，研究系统构建了多种mcjA前体基因插入变体，比较环区、loop区和尾区对单个或多个氨基酸插入的兼容性。结果显示，环区插入会破坏套索拓扑形成，主要生成支链环肽（branched-cyclic peptide）；尾区延长虽然能够形成套索肽，但产率显著降低；与之形成鲜明对照的是，loop区对插入表现出极高的兼容性，不仅能够容纳多个额外残基，还允许酸性、碱性、大体积和小体积等不同类型的氨基酸进入该区域，同时大多数变体仍能以接近野生型（WT）的产率生成成熟套索肽。这一发现从机制上支持了McjC腔体具有较大容纳空间的推断，也表明loop区是MccJ25工程化改造的优选窗口。

在技术方法方面，研究人员主要采用前体基因mcjA克隆改造构建不同插入变体，并在异源表达体系中获得目标产物；通过热溶菌蛋白酶（thermolysin）消化联合质谱（MS）及串联质谱分析，判定各变体是否形成套索拓扑还是支链环肽拓扑；通过高效液相色谱（HPLC）峰面积并以内标咖啡因定量评估产量；通过对大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655进行半定量生长抑制圈实验评价抗菌活性；同时结合AlphaFold结构预测、CASTpFold腔体体积估算及LassoPred预测，对酶-底物复合体空间特征和loop构象进行辅助分析。

在研究结果部分，论文首先在“The MccJ25 biosynthetic machinery tolerates a wide range of AA insertions”这一部分系统证明了MccJ25生物合成机制对不同区域插入的差异性耐受。研究人员构建了环区单Ala插入、loop区单Ala插入以及尾区单Gly延长变体。结果表明，环区插入的RA1不能形成套索拓扑，而是生成支链环肽；尾区TG1虽能形成套索肽，但产率约仅为野生型的1/30；而loop区LA1不仅成功形成套索拓扑，而且产量达到32 mg L^?1，略高于野生型。这一结果直接证明，与环区和尾区相比，loop区是对插入最为宽容的结构区域。随后，研究进一步构建LA3、LA5、LA7、LA10和LG10等含多个同源插入残基的变体，以及在loop两侧同时插入的LA1A1变体，甚至得到总共增加15个残基的LG15大插入变体。结果显示，这些变体均可形成套索拓扑，说明loop区不仅能容纳单残基插入，也能容纳显著长度扩展。

在“Structure determination through thermolysin digestion coupled to MS analysis”这一部分，研究人员建立并应用了热溶菌蛋白酶消化结合质谱分析的结构判定流程。其原理在于：若底物为套索肽，loop区被切割后会生成被大环困住的线性肽段，作为单一机械互锁分子在MS中表现为单一分子种；若为支链环肽，则蛋白酶切割后会形成彼此分离的两个片段，MS图谱中可清晰区分。通过该方法，研究确认表中各个loop插入变体均保持套索拓扑，而RA1则不具备该特征。这一分析不仅验证了产物拓扑，也为后续讨论McjC酶腔对插入的包容性提供了直接实验依据。值得注意的是，各变体产量在1.0–32 mg L^?1之间波动，插入长度和序列与产率之间未呈现明显相关性，提示生物合成效率并非简单由插入规模决定。

在关于插入氨基酸类型耐受性的研究中，论文进一步构建了LARA、LSARAE和LG₂S₂G₂S₂G₂等变体，以考察loop区对不同理化性质残基的适应性。其中，Ser带有可供氢键供受体作用的羟基，Glu在中性pH下带负电荷，Arg带正电荷且是20种经典氨基酸中体积较大的成员。实验结果显示，这些含有酸性、碱性及较大侧链残基的变体依然能够被McjB/McjC加工为套索肽。这说明MccJ25生物合成系统对loop区氨基酸身份与序列组成的容忍度远高于先前对替换工程的认识，也提示McjC腔体的空间和化学环境足以支持多类型插入。

在抗菌功能评估部分，研究采用大肠杆菌MG1655抑菌圈实验对变体活性进行半定量比较。结果显示，loop区插入总体上会削弱抗菌活性，但活性下降程度与插入残基数目或序列之间并无明确线性关系。例如，多Ala插入较多的变体活性很低甚至完全丧失，而两个较大的插入变体LG10和LG₂S₂G₂S₂G₂仍保留中等活性。研究据此指出，尽管生物合成对loop扩展高度耐受，但抗菌功能对该区域改动更加敏感。结合既往结构生物学研究，作者认为这种活性下降更可能与外膜转运蛋白FhuA介导的摄取受损有关，而不一定意味着与RNA聚合酶的靶标结合完全丧失。因为MccJ25的环区和尾区才是与RNA聚合酶关键相互作用更为直接的区域，而loop与ring则对FhuA识别更为重要。

在“Conclusion and discussion”部分，研究人员总结指出，本研究最重要的贡献在于证明MccJ25前体工程不应局限于点替换，而可以通过loop区插入实现更大尺度的骨架扩展。研究证实，在Gly12/Ile13之间最多可插入15个额外残基，且在loop两侧分别插入残基的策略同样可行；同时，酸性、碱性、大、小不同类型氨基酸都能被体系接受，多数变体产率与野生型相当。这些结果与AlphaFold预测的McjC较大内部腔体相一致；CASTpFold估算该腔体体积约为2800 ?³，为容纳扩展loop提供了结构基础。LassoPred对变体的预测还提示，这些扩展后的loop区仍倾向形成紧凑的β-转角样构象，从而可能有助于维持整体可加工性。

从应用意义看，论文强调MccJ25是一种刚性强、耐蛋白酶、耐极端pH和温度的分子支架，天然就适合被开发为蛋白结合配体或功能展示框架。以往通过连续氨基酸替换实现表位嫁接，虽然可将整合素结合基序或von Willebrand factor结合基序导入MccJ25，但常伴随产率下降，限制了实际应用。相比之下，本研究发现的tail延长与尤其是loop插入耐受性，为向MccJ25支架中导入更长、更复杂、更多样的功能表位提供了新的工程路线。这不仅为构建新型机械互锁分子提供了方法学基础，也为固相固定化、噬菌体展示、细菌展示或酵母展示等应用场景带来潜在可能。

研究结论可概括为：MccJ25生物合成酶能够将loop区显著扩展的前体变体高效加工为套索拓扑产物；该体系对多达15个额外氨基酸以及多种氨基酸类型具有较高耐受性；尽管loop插入通常削弱抗菌活性，但这一策略显著拓宽了MccJ25作为稳定套索肽支架进行功能化改造的空间，为后续生物活性配体嫁接和机械互锁肽分子设计提供了新的方向。