传染性鲑鱼贫血症病毒（Infectious Salmon Anaemia Virus，ISAV）感染大西洋鲑（Salmo salar）的眼部表现

《Journal of Fish Diseases》：Ocular Manifestations of Infectious Salmon Anaemia Virus Infection in Atlantic Salmon (Salmo salar)

　　

眼睛是硬骨鱼类大西洋鲑在水中与养殖环境中实现高视觉敏锐度与生存所必需的重要感觉器官。本研究通过共居介导的感染实验（cohabitation-mediated infection assay）以及组织学与免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）方法，评估了传染性鲑鱼贫血症病毒（Infectious Salmon Anaemia Virus，ISAV）感染大西洋鲑（Salmo salar）的眼部表现。研究结果显示，发生系统性ISAV感染的大西洋鲑在特定的眼组织中出现ISAV抗原蓄积，并伴有可损害视觉敏锐度的显著眼部形态学改变。免疫组织化学分析表明，ISAV相关的眼部病理变化与IgM、Sox6、Sox9、Ⅰ型胶原（collagen type 1）、Gata1及CD10在特定眼区室中的表达水平和（或）空间定位变化相关。角膜很可能是共居介导的ISAV感染最早接触的眼组织之一。ISAV感染的大西洋鲑表现出角膜发育不良，这与角膜基质ISAV抗原表达增加、IgM、Sox6和Ⅰ型胶原（collagen type 1）表达失调，以及角膜表面Sox9表达诱导相一致。ISAV感染眼的脉络膜奇网（choroid rete mirabile）红细胞数量减少，与贫血表现一致；而作为红细胞生成关键介导因子的Gata1表达相较于非感染眼上调，提示可能存在红细胞生成的代偿反应。上述发现为进一步研究ISAV介导的眼部病理变化提供了基础，并为理解正黏病毒（Orthomyxoviridae）在眼部的发病机制提供了新见解。

论文发表于《Journal of Fish Diseases》。研究背景方面，传染性鲑鱼贫血症病毒（Infectious Salmon Anaemia Virus，ISAV）属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）鲑传贫病毒属（Isavirus），可致大西洋鲑（Salmo salar）发生致死性传染性鲑鱼贫血症（Infectious Salmon Anaemia，ISA），以急性贫血、内脏出血和高死亡率为特征，对鲑鱼养殖业造成重大社会经济影响。既往研究表明ISAV主要经鳃、皮肤、鳍等黏膜表面进入宿主，引起全身性内皮感染， virulent株可造成系统性病变；虽有报道在眼部检出ISAV，但一般认为眼部是通过心血管系统继发感染而非原发入口，且正黏病毒科其他成员（如流感病毒的H1N1）已知可感染人眼组织并引起视网膜病变等，而ISAV对鱼眼的具体病理影响及分子机制尚缺乏系统研究。因此研究人员开展此项工作，旨在明确ISAV感染大西洋鲑的眼部病理改变、相关分子标志物动态及可能的原发感染路径，从而拓展对ISAV眼组织病理生物学（pathobiology）的认识，也为正黏病毒（Orthomyxoviridae）眼部致病机制提供新模型。

关键技术方法上，研究人员采用共居感染模型：使用高毒力ISAV-HPR4分离株（RPC/NB 04-085-1）经腹腔注射感染供体大西洋鲑（Salmo salar），按1∶5供体与接触鱼比例共养建立水平传播感染；样本来源为大西洋鲑（Salmo salar）实验群体，非感染对照取自同批次健康个体。对采集的眼组织进行常规石蜡包埋，开展多种组织学染色（Giemsa、Prussian blue、Herovici、RGB-trichrome、Verhoeff/elastin）；采用免疫组织化学（IHC）检测ISAV抗原、IgM、Sox6、Sox9、Ⅰ型胶原（collagen type 1）、Gata1、CD10等标志物的表达与定位；部分切片做免疫荧光（immunofluorescence）共聚焦Z叠扫成像；利用蛋白质免疫印迹（western blotting）验证Sox6、Gata1抗体在鲑鱼组织的交叉反应性；通过序列比对（BLAST、COBALT）分析人与鲑鱼相关蛋白的同源性以支持抗体适用性。

研究结果部分保留小标题并简述如下：

3 Results（结果）：蛋白质免疫印迹（western blotting）显示Sox6在大西洋鲑脉络膜奇网（choroid rete mirabile）出现约112 kDa主带，Gata1出现约44 kDa主带及额外36–38 kDa条带，与人A549细胞对照迁移模式相似，结合序列比对证实所用哺乳动物源抗体可与鲑鱼同源蛋白交叉反应。免疫组织化学（IHC）显示IgM阳性细胞存在于中央角膜上皮，感染组上皮层状结构紊乱且基质IgM信号增强；Sox6在正常角膜未检出，感染组基底区近Bowman膜表达阳性；Sox9在正常角膜阴性，感染组表达于上皮外层；中央角膜基质CD10染色模式两组相似（标记角膜细胞）；组织学证实感染组中央角膜上皮分层丧失、结构无序。角膜缘区感染组ISAV抗原与Ⅰ型胶原（collagen type 1）表达上调，组织学显示细胞浸润、胶原分布改变、角膜缘上皮发育不良伴可能的细胞外血红蛋白沉积。眼睑皮肤感染组Sox9核表达阳性且上皮失去正常分层形态。脉络膜奇网（choroid rete mirabile）感染组ISAV抗原主要见于血管壁，组织与RGB-trichrome染色示成熟红细胞（fast-green强染）减少、小圆形红/橙染细胞密度增加，血管结构紊乱；Gata1在正常鱼主要限于细毛细血管壁，感染组在血管壁及大量圆形细胞中上调，共聚焦免疫荧光证实Gata1阳性紧密簇位于Gata1阳性血管样结构围合区内，伴红细胞自身荧光。神经视网膜感染组ISAV抗原集中于内视网膜离散区，Giemsa染色全视网膜严重菊形团（rosetting）形成，内核层散射、视杆视锥层增厚；视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）与脉络膜间的Bruch膜在感染组变薄或消失（IgM-IHC与Verhoeff elastin染色证实Bruch膜弹性纤维退化）。眼外肌感染组CD10在肌原纤维表达强度高于正常，呈横纹与斑点状；Herovici染色示肌纤维红褐色加深、肌原纤维退变伴白细胞样细胞浸润。上述病理改变在各感染个体中一致存在，正常对照未见或极轻。

讨论部分总结：研究人员指出，ISAV感染大西洋鲑眼部出现特定形态学改变与分子标志物（ISAV抗原、IgM、Sox6、Sox9、Ⅰ型胶原（collagen type 1）、Gata1、CD10）重分布，中央与角膜缘角膜上皮表达Sox9（外层）与Sox6（基底）异常，伴随IgM相关免疫反应及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）调节，提示角膜可能是共居水源感染的首批靶组织之一；角膜缘与中央区生物学差异导致不同病理表现，但上皮发育不良在两区均存在。眼睑皮肤Sox9核表达与结构紊乱提示皮肤亦可能为ISAV入口或高毒力株靶区。脉络膜奇网（choroid rete mirabile）ISAV抗原富集于血管壁，成熟红细胞减少符合全身贫血，Gata1上调于血管壁及圆形细胞集群可能为贫血驱动的红细胞生成代偿或涉及粒-单/巨核系分化；这些Gata1阳性细胞来源于循环或眼内原位造血尚待明确。视网膜ISAV抗原沉积与Bruch膜崩解、神经视网膜菊形团畸形、各层紊乱相关，类比人年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）中Bruch膜屏障失效。眼外肌CD10上调（标记纤维脂肪前体细胞FAPs、卫星细胞）伴Herovici染色改变与退变，可能反映ISAV诱导肌损伤后的再生尝试。既往认为ISAV眼部为血行继发感染，本研究提出脉络膜奇网（choroid rete mirabile）和（或）角膜为潜在原发入口的新可能，且眼部或可成为毒力ISAV演化的隔离储库；鉴于正黏病毒（Orthomyxoviridae）成员普遍具眼组织嗜性与经眼入侵能力，ISAV可作为正黏病毒（Orthomyxoviridae）眼病的新模型。研究受固定单时间点（感染后约30天濒死期）、IHC相关性不能推定功能、鲑鱼蛋白与哺乳动物抗体差异等限制，但通过多技术整合与对照标准化提升了发现可靠性。结论为：ISAV系统性感染大西洋鲑（Salmo salar）引起特征性眼组织病理，包括角膜（中央与缘部）上皮/基质发育不良与分子标志物失调、眼睑皮肤病变、脉络膜奇网（choroid rete mirabile）ISAV抗原蓄积伴Gata1上调与红细胞缺失、神经视网膜菊形团与Bruch膜破坏、眼外肌CD10上调与退变；这些改变为ISAV眼病理生物学提供基础，并扩展了对正黏病毒（Orthomyxoviridae）眼部发病机制的理解。