《Advanced Healthcare Materials》：Tracking Spatiotemporal Extracellular Matrix Evolution and Tissue Fusion in 3D Microtissues via Click Chemistry-Based Metabolic Labelling
编辑推荐：
摘要：细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）是由大分子构成的复杂网络，形成细胞微环境。ECM形成的正确调控对于维持组织稳态至关重要，了解组织生长、成熟及退变过程中涉及的复杂过程对开发功能性再生方案具有重要意义。然而，在细胞致密的工程化
摘要：细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）是由大分子构成的复杂网络，形成细胞微环境。ECM形成的正确调控对于维持组织稳态至关重要，了解组织生长、成熟及退变过程中涉及的复杂过程对开发功能性再生方案具有重要意义。然而，在细胞致密的工程化三维（3D）组织中研究大规模ECM动态变化仍然是一大挑战。为此，研究人员提出了一种技术，对三维软骨微组织中新生蛋白进行代谢标记并追踪ECM的时空演化。非经典氨基酸L?azidohomoalanine（L?AHA）被掺入新分泌的蛋白中并经荧光标记，从而实现对新生基质的可视化。分别在微组织形成早期（第1天）、中期（第7天）或晚期（第14天）对软骨微组织进行标记，发现新生蛋白沉积在微组织周边区域增加。比较不同时间点的蛋白分泌，观察到晚期较早期仅有极少ECM形成相比有明显更多的蛋白沉积。此外，利用三维生物组装模型研究了微组织融合过程中的蛋白沉积，可追踪组织整合随时间的变化。总之，该方法是研究动态三维微环境中组织形成机制的有力工具，在临床相关尺度上具有潜在再生策略应用价值。
论文解读：《Advanced Healthcare Materials》—基于点击化学代谢标记追踪三维微组织中ECM时空演化及组织融合
一、研究背景与立项依据
传统分析细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）形成的方法存在明显局限：生化检测和基因表达谱虽可提供定量整体数据，但丢失空间分辨信息，尤其不适用于大型三维（3D）构建体；组织学及免疫组化可定性观察基质形成，但缺乏时间信息且仅反映实验终点状态。代谢标记（metabolic labeling）利用含生物正交官能团的非经典氨基酸掺入新生分泌蛋白，再通过点击化学（click chemistry）可视化，已在单细胞及水凝胶嵌入细胞中被报道，但在高密度细胞的三维微组织（microtissue spheroid）及微组织融合（tissue fusion）过程中尚未见应用。软骨微组织可模拟体内软骨发育的细胞凝集及软骨形成过程，是再生医学和组织工程的重要模型。因此，研究人员采用基于L?azidohomoalanine（L?AHA）和无铜点击化学反应的代谢标记策略，旨在揭示三维软骨微组织ECM沉积的时空动态及微组织融合过程中的基质整合情况。
二、主要关键技术方法
研究人员从接受前交叉韧带重建术患者正常关节软骨中分离原代人关节软骨细胞（human Articular Chondrocytes, hACs），经体外扩增至第3代后，于V形底96孔板中离心法形成高密度软骨微组织球体。采用甲硫氨酸缺失（Methionine?Free, MF）软骨诱导分化培养基，分别设置100?μM L?AHA短期（24?h脉冲）或长期（连续添加）处理组，并以添加100?μM L?methionine（MET）组为阴性对照；AHA掺入的新生蛋白通过二苯并环辛炔偶联荧光染料（Dibenzocyclooctyne?fluorophore, DBCO）经无铜应变促进叠氮?炔环加成（Strain?Promoted Azide?Alkyne Cycloaddition, SPAAC）反应荧光标记。微组织融合模型通过将两个预培养10天的微组织装入3D打印聚己内酯（Polycaprolactone, PCL）支架孔中共同培养14天。检测手段包括：二甲基亚甲蓝（1,9?Dimethyl?Methylene Blue, DMMB）法测糖胺聚糖（Glycosaminoglycan, GAG）含量、CyQUANT法测DNA含量、SDS?PAGE及荧光检测验证AHA/DBCO共价结合、冰冻切片行番红O（Safranin?O）/快绿及Ⅰ型/Ⅱ型胶原免疫荧光染色、TUNEL凋亡检测、共聚焦/荧光显微镜成像，并使用ImageJ软件进行新生蛋白荧光强度径向分布及融合区共定位（Pearson相关系数）定量分析。
三、研究结果
3.1 Cartilage Microtissue Formation and Growth
研究人员将hAC微组织在正常软骨诱导培养基中培养至28天，Safranin?O染色显示第3天无GAG、第10天起明显GAG沉积；微组织直径与GAG总量随培养时间单调增加，而DNA含量在第3天（1.5?±?0.2?μg）与第28天（1.8?±?0.2?μg）间无显著差异，表明细胞数基本恒定、无明显增殖；GAG/DNA比值显著升高。Ⅰ型胶原（Collagen I）与Ⅱ型胶原（Collagen II）免疫荧光显示Collagen II/Collagen I比值在第10天后显著上升，提示透明软骨表型基质形成。TUNEL检测未见明显凋亡核心区，细胞在全层保持活性。因此后续重点分析早期（≤14天）ECM沉积动态。
3.2 AHA Affects Microtissue Development in a Time? and Dose?Dependent Manner
研究人员在MF培养基中以100?μM AHA或50?μM AHA＋50?μM MET处理微组织1、3、7、10天。结果显示：新生蛋白荧光信号随AHA作用时间延长而增强（10天组较1天组升高约14.5倍），证实时间依赖性掺入；但100?μM AHA持续处理＞1天导致GAG沉积显著下降、微组织面积缩小（10天组减小约65%），且Collagen II/I比值降低，提示高剂量长时间AHA干扰软骨基质合成。相反，仅24?h脉冲的100?μM AHA对GAG含量及Collagen II/I比无显著影响；50?μM AHA＋50?μM MET混合培养基则可在长达10天处理中维持正常软骨表型。由此确定后续时空标记采用100?μM AHA 24?h脉冲方案。
3.3 Spatial Protein Deposition in Microtissues
微组织培养14天，末24?h给予100?μM AHA后进行SPAAC荧光标记。扣除细胞内CellMask信号后发现：新生蛋白广泛分布于微组织截面，但周边区荧光强度最高；径向扫描显示中心至周边蛋白信号平稳上升并于最外围达峰值，而细胞核密度沿半径均匀分布。单位细胞归一化后，周边区每细胞新生蛋白分泌较中心上调约3.3倍，提示周边细胞代谢活性更高而非细胞密度差异导致。
3.4 Temporal ECM Evolution During Microtissue Growth
分别在培养第1天（早期）、第7天（中期）、第13–14天（晚期）给予24?h AHA脉冲。中心区：早期几乎无ECM荧光，中期较早期显著升高，晚期较中期再升高约1.6倍。周边区：早期同样极低，中期较早期升高约11倍，晚期较中期下降约30%但仍高于早期。结果表明ECM合成在第1天处于起始阶段，第7天左右达分泌高峰，后期周边活性略有回调。
3.5 Tracking of Tissue Formation During Microtissue Fusion
将两个预培养微组织置入PCL支架融合培养14天，分别于融合第1、7、14天给24?h AHA脉冲。融合第14天标记显示两微组织间融合区有明确边界但可见新生蛋白沉积，细胞迁移极少。融合第1天新生蛋白主要位于微组织周边，融合间隙极少，且与Collagen II共定位程度（Pearson系数）高于Collagen I；融合第7天融合区及微组织内新生蛋白沉积明显增多，与Collagen I及Collagen II的共定位均较第1天增强，仍以保持与Collagen II较高共定位为特征。说明代谢标记可清晰追踪融合界面新生ECM时序变化。
四、讨论与结论总结
讨论指出，本研究首次将AHA?based代谢标记结合SPAAC点击化学应用于高密度细胞三维软骨微组织及其融合过程，克服了传统方法缺失时空信息的瓶颈。100?μM AHA适用于短脉冲（≤24?h）标记且不损害软骨表型，长期标记建议使用50:50 AHA:MET混合培养基。微组织周边ECM分泌活跃可能与氧和营养梯度有关，本研究中未出现坏死核心，与软骨体内低氧微环境相适应。时间动态显示早期（24?h）为细胞凝集期ECM分泌少，随后胶原II及GAG渐增。融合模型中新生基质先于融合间隙出现并随时间累积，主要与Collagen II共定位，为模块化组织工程提供机理依据。
结论：研究人员建立了一种基于点击化学代谢标记的活体兼容方法，可特异性、时空分辨地可视化三维软骨微组织中新生ECM沉积及微组织融合过程中的基质整合，揭示了微组织周边ECM高分泌活性及ECM随时间演化的规律，为理解三维组织形成机制及开发功能性组织工程再生策略提供了有力工具。
