中性粒细胞仿生MRI实现卒中后血管炎症的超早期检测

《Advanced Healthcare Materials》：Neutrophil-Mimetic MRI Enables Ultra-Early Detection of Vascular Inflammation After Stroke

　　

缺血性脑卒中发生后，中性粒细胞黏附于活化的脑内皮细胞会触发初始炎症级联反应。实时、定量的活体检测这种早期相互作用有助于识别最可能从免疫调节治疗中获益的个体。为实现这一目标，研究人员分析了脑组织的单细胞RNA测序数据，鉴定出E-选择素（Sele）是活化的内皮细胞中选择性上调的最早黏附分子之一，且具有静脉样转录特征。随后研究人员开发了靶向E-选择素（E-selectin）的氧化铁微粒（MPIO），旨在模拟中性粒细胞黏附并作为MRI探针用于早期内皮活化检测。注射数秒内，这些探针即在脂多糖（LPS）诱导的神经炎症模型和缺血性脑卒中模型中黏附于炎症血管，可实现快速急诊成像。研究人员观察到在LPS刺激后早至4小时、卒中后8小时即可检测到MRI信号。这种结合与中性粒细胞浸润显著相关，但与病灶体积、血脑屏障（BBB）破坏以及T细胞和单核细胞衍生细胞的聚集无关。这些发现证明了其对中性粒细胞驱动炎症的特异性，及其作为超早期免疫活化生物标志物的相关性。结果表明，中性粒细胞仿生MRI探针可代表一种有望用于检测卒中诱导炎症初始阶段并指导个体化免疫调节策略的方法。

该研究发表在《Advanced Healthcare Materials》。研究背景方面，缺血性脑卒中是成人死亡和慢性功能障碍的主要原因，除初始血管事件外，快速动态的免疫反应随之展开，其中中性粒细胞是最早上缺血脑组织浸润的免疫细胞，黏附于活化内皮细胞并启动早期炎症级联。临床前免疫调节治疗在卒中中有治疗潜力，但转化为临床获益困难，多数试验未显示显著疗效，关键限制在于缺乏基于炎症谱对患者进行分层（stratification）的工具。近期免疫表型数据显示症状出现3小时内早期免疫反应存在显著变异，仅部分患者可能受益于抗炎干预，然而当前临床影像模态无法在此超急性时间窗内可视化或定量神经炎症。免疫磁共振成像（immuno-MRI，即利用抗体偶联氧化铁微粒靶向内皮黏附分子的MRI）可实现高空间分辨率、无电离辐射的活体炎症血管活化检测，既往靶向血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、黏膜地址素细胞黏附分子-1（MAdCAM-1）、黑色素瘤细胞黏附分子（MCAM）、P-选择素（P-selectin）等策略能在卒中后24小时至数天检测炎症，但缺乏在卒中后数小时内即免疫–血管相互作用首次出现、治疗机会最大的超早期阶段揭示血管活化的新方法。因此研究人员开展本研究，旨在开发模拟中性粒细胞（卒中后脑缺血最早应答免疫细胞）行为的成像策略，通过分析单细胞RNA测序数据鉴定出Sele（编码E-selectin，CD62E）是卒中后内皮细胞（具静脉样转录特征）选择性上调的关键黏附分子，随后制备超顺磁氧化铁微粒（MPIO）偶联抗E-selectin单抗的仿中性粒细胞探针MPIO-αE-selectin，在LPS诱导的神经炎症模型和小鼠缺血性卒中模型中验证其体内外特异性、动力学及与中性粒细胞浸润等事件的相关性，得出MPIO-αE-selectin可快速特异性黏附活化内皮、在LPS模型4小时、卒中模型8小时即可产生MRI信号void、信号与中性粒细胞浸润正相关而与病灶体积、血脑屏障破坏、T细胞及单核细胞衍生细胞聚集无相关性的结论，意义在于提供了超早期非侵入性检测卒中后脑血管炎症及中性粒细胞驱动炎症的方法，可为按炎症状态分层患者、指导个体化免疫调节干预提供影像依据。

主要关键技术方法：研究人员使用公开批量RNA测序数据集（内皮细胞隔离自 na?ve 小鼠与各疾病阶段卒中模型小鼠）及单细胞RNA测序数据集（对照组与线栓法卒中模型小鼠脑转录组，术后2天取样）进行转录组分析以筛选早期内皮活化标志物；制备甲苯磺酰活性表面MPIO（直径约1.08 μm）偶联抗E-selectin单抗（clone 9A9）、对照IgG、抗P-selectin单抗，通过流式细胞术、共聚焦显微镜、动态光散射、扫描电镜（SEM）、7T MRI测弛豫率（r₁、r₂、r₂）表征；采用鼠脑内皮细胞系bEnd.3在Ibidi流动腔系统施加剪切应力（4 dyn/cm²）进行体外动态结合实验；动物模型包括小鼠纹状体内注射大肠杆菌脂多糖（LPS，1 μg）诱导神经炎症模型、永久性大脑中动脉闭塞（MCAO，氯化铝浸渍滤纸法）卒中模型；体内成像采用7T MRI（T2加权3D FLASH、T1加权钆对比）、双光子活体显微镜（颅窗模型）、磁粒子成像（MPI）；生物学验证通过转录组分析、流式细胞术（内皮E-selectin表达、脑免疫浸润细胞分型：CD45^high/Ly6G⁺中性粒细胞、CD4⁺、CD8⁺T细胞、CD206⁺单核细胞衍生细胞等）、酶联免疫吸附测定（ELISA）定量脑E-selectin、免疫荧光/免疫组化（E-selectin、P-selectin、Ly6G、CD3、层粘连蛋白等）、Evans蓝渗出评估血脑屏障通透性；统计根据数据分布选用Student t检验、Mann–Whitney U检验、单因素ANOVA（Holm–?ídák或Tukey事后）、Kruskal–Wallis（Dunn多重比较）、Pearson或Spearman相关检验。

2 Results（结果）

2.1 RNA Sequencing Identifies Selectins as Potential Markers of Early Endothelial Activation in a Model of Ischemic Stroke（RNA测序鉴定选择素作为缺血卒中模型早期内皮活化潜在标志物）：通过分析批量RNA测序发现 na?ve 小鼠脑内皮细胞无Sele（E-selectin）和Selp（P-selectin）表达但有基础Vcam1和Icam1表达；卒中后亚急性期（72小时）脑内皮细胞Sele和Selp显著上调，而Vcam1和Icam1无显著变化；单细胞RNA测序解析内皮亚型（基于Pecam1、Cldn5及血管床标记）显示Sele和Selp表达仅限于具静脉样转录特征的内皮细胞且仅在卒中动物检出，Sham动物无表达，而Vcam1和Icam1在基础条件下即有表达；结论为P-selectin和E-selectin因健康时无表达、卒中时上调，是immuno-MRI的有前景候选靶点。

2.2 MPIO with a High Specificity for E-Selectin Unmasks Neuroinflammation（高特异性靶向E-selectin的MPIO揭示神经炎症）：研究人员制备MPIO-αE-selectin（偶联clone 9A9单抗），表征确认抗体偶联成功（流式、共聚焦）、粒径约1090 nm（PDI 0.058）、Zeta电位?12.7 mV（pH7.4）、SEM显示均匀、7T下r₂=64.28 mM^?1s^?1、r₂=516.71 mM^?1s^?1、r₁可忽略；LPS纹状体注射24小时后尾静脉注入MPIO-αE-selectin（1 mg/kg Fe）行T2MRI，右侧纹状体见大量信号void，对照MPIO-IgG无显著差异，na?ve小鼠无void；免疫组化确认E-selectin血管表达且颗粒仅结合LPS注射侧，>91%血管结合颗粒与E-selectin共定位（腔面）；双光子活体成像（腹腔LPS模型，颅窗）显示注射后约60秒循环颗粒达峰然后快速下降，160秒仅见血管壁结合颗粒，MPIO-αE-selectin在LPS后24小时结合脑血管壁腔面E-selectin、无血管外渗，血浆半衰期亚分钟；竞争实验预先注射游离抗E-selectin单抗饱和位点可阻断MRI信号void，证明特异性；重复成像15和150分钟显示150分钟颗粒脱落，符合腔面结合无外渗；MPI生物分布示约2.5%注射剂量短暂结合脑血管，其余快速肝脾摄取（网状内皮系统）；体外bEnd.3细胞TNF-α（100 ng/mL）激活后流式证实E-selectin上调，流动腔（4 dyn/cm²，5分钟）显示MPIO-αE-selectin特异性结合活化内皮远强于MPIO-IgG及静息内皮；结论为MPIO-αE-selectin对活化内皮具高特异性。

2.3 MPIO-αE-Selectin Reveals Early Endothelial Activation Occurring During LPS-Induced Neuroinflammation（MPIO-αE-selectin揭示LPS诱导神经炎症期间的早期内皮活化）：ELISA显示脑E-selectin在纹状体LPS后4小时即上调；同一小鼠先后行MPIO-αP-selectin、MPIO-αE-selectin注射T2* MRI，LPS后4小时MPIO-αE-selectin产生显著信号void且强于MPIO-αP-selectin，荧光显微镜一致；免疫荧光显示MPIO-αE-selectin与Ly6G⁺中性粒细胞在同一内皮部位结合，说明靶向E-selectin的immuno-MRI能揭示早期中性粒细胞黏附炎性脑血管；流式显示MPIO-αE-selectin与对照MPIO-IgG脑浸润中性粒细胞频率无差异，因MPIO结合短暂（窗口窄）、未持续占据位点，不干扰中性粒细胞招募。

2.4 MPIO-αE-Selectin Reveals Early Endothelial Activation Associated With Neutrophil Infiltration During Ischemic Stroke（MPIO-αE-selectin揭示缺血卒中期间伴中性粒细胞浸润的早期内皮活化）：在永久性MCAO模型于4、8、24小时、5天尾静脉注入MPIO-αE-selectin行T2* MRI，结果显示探针结合E-selectin阳性血管，信号void在8和24小时达峰，5天显著降低；void主要分布在病灶周边“炎症半暗带”；同期MPIO-αP-selectin信号较低且早期时间点无显著差异；免疫荧光E-selectin表达模式同MRI信号（8、24小时阳性，主要在直径约6.5 μm小血管）；中性粒细胞浸润始于8小时、24小时达峰，与E-selectin表达及MRI void正相关；流式证实MRI void与脑CD45^high/Ly6G⁺中性粒细胞数正相关；MPIO-αE-selectin与中性粒细胞黏附同位；MCAO后8小时注入探针、24小时Evans蓝显示血脑屏障通透性两组无差异，免疫荧光中性粒细胞计数无差异，说明探针不干扰急性缺血损伤的中性粒细胞招募与血脑屏障通透。

2.5 The Kinetics of E-Selectin Expression Differ From Those of BBB Disruption and T Lymphocyte and Monocyte Invasion During Ischemic Stroke（E-selectin表达动力学不同于缺血卒中期间血脑屏障破坏及T淋巴细胞和单核细胞入侵的动力学）：同一小鼠在MCAO后8小时、24小时、5天先行MPIO-αE-selectin T2* MRI评估E-selectin，后注钆行T1 MRI评估血脑屏障通透；结果MPIO void在8、24小时高、5天降低，而钆外渗体积随时间增加、5天更显著；免疫组化CD3⁺淋巴细胞数目随时间增加、5天显著高于8小时；E-selectin信号与钆外渗体积无相关性；流式显示void与CD4⁺、CD8⁺T细胞浸润无正相关，与单核细胞衍生细胞招募及病灶体积也无相关性；结论为靶向E-selectin的MPIO特异性模拟中性粒细胞行为，其信号特异反映中性粒细胞驱动炎症而非血脑屏障破坏、T细胞、单核细胞事件或病灶体积。

3 Discussion（讨论）：研究人员在讨论中总结，本研究开发了中性粒细胞仿生MRI探针，可快速、敏感、非侵入性检测缺血卒中后超早期血管活化；为模拟最先结合活化内皮的中性粒细胞黏附行为，设计E-selectin靶向MPIO快速黏附活化内皮细胞；探针体外在生理流下选择性结合活化脑内皮（TNF-α诱导E-selectin上调经流式验证），体内对腔面E-selectin具高特异性且结合后快速清除，适合重复纵向成像；相比P-selectin靶向MPIO，E-selectin靶向MPIO更有效捕获早期内皮活化；MRI信号void与中性粒细胞浸润幅度相关，而与病灶体积、血脑屏障通透性、T细胞和单核细胞衍生细胞聚集无关，强调其对中性粒细胞驱动炎症的特异性；该策略可为治疗窗内按炎症状态分层患者提供新视角，最终支持急性卒中个体化免疫调节干预。当前仅正电子发射断层扫描（PET）用于人类分子成像，通过转位蛋白（TSPO）可视化神经炎症但信噪比差、卒中后数天才升高、低空间分辨、电离辐射、长采集；脑脊液生物标志物可检测中枢神经系统炎症但不适于需快速处理的急性卒中、不能定位、采样延迟；临床研究显示急性缺血卒中患者血可溶性E-selectin升高，但血水平反映既往细胞表面脱落累积、不能捕捉当前脑血管内皮活化时空分布；本探针直接可视化脑血管内皮腔面E-selectin，克服上述局限，且人类诱导多能干细胞来源内皮细胞（hiPSC-ECs）炎症后也上调E-selectin，支持临床转化相关性。Immune-MRI具良好空间分辨与灵敏度，既往VCAM-1、ICAM-1、P-selectin靶向MPIO在卒中后1–21天检测炎症，而RNA测序及文献示E-selectin表达早于其他黏附分子，且脑内皮无Weibel-Palade小体故不储存P-selectin，E-selectin在中枢白细胞招募中起主导早期作用，更适合超早期神经炎症成像靶点；本研究成功制备抗E-selectin MPIO，使MCAO后8小时MRI检测早期内皮活化成为可能；E-selectin表达与中性粒细胞（最先浸润白细胞）相关，符合E-selectin参与中性粒细胞炎性体激活及卒中浸润的作用；MPIO-αE-selectin信号强于MPIO-αP-selectin，因E-selectin仅活化内皮表达确保所有循环MPIO-αE-selectin可用于血管结合，而P-selectin还表达于活化血小板和免疫细胞致血流中MPIO-αP-selectin被结合消耗、可用内皮结合池减少，抗体亲和力差异也可能贡献。选用微米级氧化铁颗粒（MPIO）而非纳米颗粒，优势是单颗粒载更多氧化铁、靶结合对比剂量大，注射后无需等待被动积累即可快速成像；未结合MPIO血浆半衰期数秒（纳米颗粒数小时）；MPIO即使血脑屏障通透也不能跨血管壁，MRI信号仅来自腔面结合颗粒而非组织被动蓄积；MPIO-αE-selectin水动力直径约1.09 μm，小于小鼠毛细血管典型管腔（约5 μm）和红细胞直径（6–7 μm），双光子显示微循环自由循环无停滞梗阻，高单分散（PDI 0.058）及网状内皮系统快速清除未结合颗粒避免累积血管阻塞；MPIO与中性粒细胞共用E-selectin结合位点但因结合短暂（未结合秒级清除）、竞争窗口极窄，不干扰中性粒细胞招募（流式、Evans蓝、免疫荧光证实）；本研究局限是用非生物降解MPIO，但研究人员既往已报道可生物降解MPIO（纳米颗粒簇可被网状内皮系统降解）；MPIO铁剂量（1–4 mg/kg）兼容人类临床（临床纳米颗粒铁注射达1000 mg耐受良好，同内源铁存储代谢无不良效应）；结合本研究，这些要素支持未来immuno-MRI用中性粒细胞仿生MRI探针临床转化以超早期检测卒中诱导急性神经炎症。