基于荧光侧向层析技术检测人血清中代谢标志物瘦素的试纸条研发

《Sensors & Diagnostics》：Development of a fluorescent lateral flow test for the detection of the metabolic biomarker leptin in human serum

　　

研究人员开发了一种用于检测瘦素的夹心式侧向层析免疫分析（Lateral Flow Immunoassay, LFA），将捕获抗体固定于硝酸纤维素膜上，并将荧光铕(III)螯合物聚苯乙烯微球与检测抗体偶联。该LFA原型成功检测了缓冲液和50%小牛血清中掺入的重组人瘦素，浓度范围为0.25–100 ng mL^?1，在台式及便携式铕荧光读数仪中两种基质下的估计检出限（空白+3.3σ）均为0.25 ng mL^?1。此外，该LFA原型在含有25%人血清的样本中检测到低至0.21 ng mL^?1的内源性瘦素。检测线与质控线的信号强度比值与酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）测定的瘦素浓度呈强相关性，整个样本集（n = 30）的Pearson相关系数在台式读数仪为r = 0.96，在便携式读数仪为r = 0.95（均p < 0.0001）。该LFA的检测范围和灵敏度使其能够在生理相关浓度下检测内源性瘦素。这些发现突显了开发用于即时检测场合检测瘦素及其他代谢相关标志物的稳健LFA的潜力。

**研究背景与意义**

代谢改变和肥胖主要以体重指数（Body Mass Index, BMI）≥30 kg m^?2进行诊断，但BMI存在局限性且在不同人群中的意义可变。代谢标志物如脂肪因子（adipokines）能提供更精确的信息，并有助于更早诊断如妊娠期糖尿病等疾病。瘦素（leptin）是一种调节 satiety 和能量消耗的脂肪因子，与脂肪组织质量直接相关，其升高水平与肥胖相关。尽管瘦素具有重要的代谢意义，但目前尚无商业化的即时检测（Point-of-Care, POC）方法用于瘦素检测。研究人员基于这一空白，致力于开发一种高灵敏度、易于使用的荧光LFA，以实现瘦素的快速、可及性检测，该研究发表于《Sensors》。

**主要技术方法**

本研究采用的核心技术方法包括：（1）铕(III)螯合物聚苯乙烯微球作为荧光标记物的免疫层析技术；（2）抗体定向优化策略，筛选捕获抗体与检测抗体的最佳组合；（3）运行缓冲液优化，通过系统比较不同缓冲液配方以获得最佳信噪比；（4）两种读数平台——台式时间分辨荧光读数仪（LTRIC-600）和便携式铕荧光读数仪（Cube reader）——进行信号读取与性能比较；（5）与金标准ELISA的定量相关性验证。样本来源为Gulf Coast Regional Blood Center（Houston, TX）提供的30例去标识化人血清样本，包括10例性别未知、10例男性和10例女性样本。

**研究结果**

**荧光LFA用于瘦素检测**：研究人员开发了基于铕(III)螯合物报告微球的POC侧向层析检测方法。该LFA在无瘦素时信号接近零，荧光信号（检测线/质控线比值）与瘦素浓度呈单调相关。通过优化颗粒浓度至0.125% solids、增加洗液体积至30 μL、延长运行时间至10分钟，实现了最低测试浓度0.25 ng mL^?1（缓冲液和小牛血清中）的检测。25%人血清稀释对应检测限为1 ng mL^?1，具有临床相关性。两批次产品的重现性验证显示变异系数（CV）为6.4%。

**运行缓冲液选择**：研究人员评估了四种运行缓冲液配方（含不同浓度的BSA、Tween-20和PEG3350）。初始筛选中，所有缓冲液在无瘦素时检测线荧光强度均接近零；加入5 ng mL^?1重组瘦素后，Buffer A（0.5% BSA和0.5% Tween-20溶于1× PBS）因阳性样本中检测线/质控线比值最高而被选为最优缓冲液。针对人血清样本，以50%小牛血清为替代基质进一步筛选，Buffer F（0.25% BSA、0.5% Tween-20和0.5% PEG3350溶于1× PBS）因信号最优而被选用。

**LFA原型在缓冲液和小牛血清中的性能**：重组瘦素系列稀释（0.25–100 ng mL^?1）检测显示，缓冲液中4参数逻辑（4PL）拟合决定系数R²为0.993（台式）和0.990（便携式），50%小牛血清中R²为0.983和0.978，最低检测浓度均为0.25 ng mL^?1。两读数仪间线性回归决定系数在缓冲液中为0.99，小牛血清中为0.98。台式和便携式读数仪的重复性CV分别低于11%和14%（缓冲液）、低于13%和15%（小牛血清）。

**人血清内源性瘦素检测**：通过ELISA定量30例人血清样本，瘦素范围为0.83 ± 0.04至62.48 ± 2.68 ng mL^?1，女性均值（21.24 ± 13.65 ng mL^?1）高于男性（14.48 ± 17.18 ng mL^?1）。选取最低浓度样本U7进行稀释优化，12.5%稀释度（估计0.10 ng mL^?1）的检测线/质控线比值首次显著异于空白，但选择25%稀释度进行后续验证，因其变异系数低（台式3.7%，便携式5%）且信号清晰。30例25%稀释人血清样本的LFA检测显示低变异（CV <10%），与ELISA的Pearson相关系数在台式读数仪达0.96（p < 0.0001，n=30），便携式读数仪达0.95（p < 0.0001，n=30），分性别分析亦显示强相关性（r = 0.94–0.98）。

**讨论与结论**

研究人员通过系统优化抗体定向、缓冲液配方和检测条件，成功开发了一种基于荧光LFA的瘦素POC检测原型。该检测在生理相关浓度范围内表现优异，与金标准ELISA高度一致，且便携式读数仪实现了与台式仪器相当的性能。与既往仅测试单例加标样本或依赖专业设备的电化学传感器不同，本研究首次使用30例人血清样本完成临床验证，凸显了LFA平台在快速、低成本、易操作方面的优势。未来可通过整合血清分离膜、标准化临床阈值、扩展多标志物panel（如脂联素等）进一步提升其临床应用价值。该技术平台可Leverage既有的侧向层析大规模生产基础设施，尤其适用于资源有限地区的代谢健康监测和人群筛查。

**研究结论**：基于荧光的LFA代表了血清代谢标志物POC检测的有前景方法，兼具灵敏度、通用性、稳健性、成本效益和便携性。本研究开发的LFA原型成功检测了生理相关浓度（0–100 ng mL^?1）的瘦素，在缓冲液和50%稀释小牛血清中的计算检出限为0.25 ng mL^?1，亦可不经加样直接检测25%稀释人血清中的内源性瘦素。台式与便携式读数仪的检测线/质控线比值与ELISA测定的瘦素水平强相关。该检测流程仅需简单稀释（1:4）、样本制备量极少，使用便携式读数仪即可快速获得稳健一致的结果，突显了其作为POC工具的潜力，尤其适用于分散化和资源有限场景。在BMI将其归类为肥胖之前，个体可能已呈现代谢改变并处于多种合并症高风险中；因此，在POC场景下更准确监测瘦素等代谢健康标志物，可通过及时生活方式干预降低高风险人群的死亡率与发病率。该LFA可作为监测瘦素水平的稳健筛查和研究工具。当前平台虽已实现与ELISA的定量相关性，但其向常规临床诊断的转化仍需进一步临床试验以建立标准化筛查/诊断阈值。未来工作将聚焦于更多人样本的临床验证，并扩展平台以纳入更多代谢相关标志物，实现全面的代谢健康监测。