综述：基于肽的响应型分子荧光探针用于精准肿瘤学

《Responsive Materials》：Peptide-based responsive molecular fluorescent probes for precision oncology

　　

精准肿瘤诊疗从根本上受到肿瘤微环境(TME)动态复杂性及显著异质性的制约。传统成像剂与治疗药物常因特异性有限，导致脱靶蓄积与欠佳的临床疗效。基于肽的响应型荧光探针已成为一类自适应功能材料，集肿瘤选择性识别、可编程刺激响应性与模块化结构可调性于一体。本综述总结了近期基于肽的分子荧光探针在精准肿瘤学中的研究进展。研究人员首先概述了TME的关键生化特征及响应型分子探针的设计原则，随后系统分类了靶向肽探针、刺激响应肽探针及集成肽探针的代表性应用。一方面，肽可作为靶向配体、刺激响应开关及层级自组装的调节单元发挥作用；另一方面，这类探针在高对比度肿瘤成像、术中导航、实时治疗监测及多模态诊疗应用中展现出显著效用。最后，本文讨论了下一代基于肽的响应型探针的新兴机遇与挑战，重点关注逻辑门控与级联响应设计、多模态成像整合、近红外二区(NIR-II)荧光团的优化及临床转化。综上，基于肽的响应型荧光探针构成了一种智能、可编程且与临床高度相关的平台，适用于精准肿瘤诊疗。

1 引言

肿瘤是一类高度异质且复杂的疾病。即使在同种肿瘤类型中，不同患者乃至单个肿瘤的不同区域，在基因组特征与分子表型上均存在显著差异，这为精准诊断与有效治疗带来了巨大挑战。传统诊断方法主要依赖组织活检与成像技术，难以捕捉肿瘤的时空动态演变。化疗与放疗等标准疗法缺乏足够特异性，常损伤正常组织，并在肿瘤异质性驱动下频繁导致耐药与复发。因此，亟需能够实时监测肿瘤微环境(TME)并自适应病理变化的智能诊疗系统。精准肿瘤学旨在基于个体病理特征实现个性化干预，然而当前临床策略仍不足以满足这些需求。肿瘤诊疗正逐步向可视化、实时反馈与精准调控一体化的闭环范式转变。该框架支持高效低毒肿瘤治疗的动态评估与自适应干预，同时对分子探针的灵敏度与功能性提出了严格要求。分子探针强调分子层面的可编程响应，可激活探针能在特定内源或外源刺激下发生可预测的结构或功能转变，在肿瘤诊疗中相比传统功能材料具有显著优势。以酸性条件、酶过表达及氧化还原失衡为特征的TME，为探针的选择性激活提供了内在基础，从而显著提升诊疗特异性。可激活探针通过受控的结构或光物理转变响应肿瘤特异性刺激，能够在病灶部位选择性激活信号，而在正常组织中保持惰性，最大限度降低背景干扰与全身毒性。荧光探针凭借高灵敏度、无创性及时空可控性等独特优势尤为突出。可激活分子荧光探针可响应病理线索选择性激活信号，从而提高成像特异性与信噪比，并实现早期病灶检测、术中切缘界定及治疗过程实时监测。近年来，具备更深组织穿透力与更高对比度的近红外二区(NIR-II, 1000–1700 nm)荧光成像(FI)，已成为一个有前景的平台。其与可激活探针设计相结合，为开发高性能肿瘤靶向荧光分子探针提供了有力策略。此外，肽作为由天然氨基酸组成的功能单元，具备优异的生物相容性、可编程结构及多样的化学修饰性，为可激活分子荧光探针的设计提供了多重功能优势。肽可通过特异性分子识别精确靶向肿瘤细胞、血管或肿瘤微环境，并通过构象变化或裂解响应特定刺激，实现可控荧光激活。作为自组装单元，它们可在肿瘤微环境中形成原位聚集体，放大信号并增强滞留，从而为高对比度成像与一体化诊疗提供新途径。基于上述特征，本综述系统总结了近期基于肽的分子荧光探针在精准肿瘤诊疗中的代表性进展，聚焦于分子设计策略、肽响应机制、荧光成像原理及自组装调控。综述从基础概念出发，依次阐述靶向肽、可激活肽及集成肽在荧光成像中的具体应用。本综述主要关注可激活分子荧光探针的代表性实例，强调其在一体化诊疗系统中的关键作用，并对该领域的未来方向进行了展望。

2 肿瘤微环境与响应型分子荧光探针

2.1 肿瘤微环境

肿瘤微环境是一个高度复杂且功能多样的系统，由肿瘤细胞及其周围基质、免疫细胞、血管网络和细胞外基质组成。其独特的生化特征为可激活分子荧光探针的开发提供了天然触发条件。首先，由于肿瘤细胞内异常的糖酵解代谢与乳酸积累，肿瘤组织通常呈现酸性微环境，局部pH低于正常组织，这一特征允许pH响应探针的选择性激活。其次，多种蛋白酶，包括基质金属蛋白酶(MMPs)、组织蛋白酶(CTSs)、碱性磷酸酶(ALP)和羧酸酯酶(CESs)在肿瘤中高表达。这些酶不仅在肿瘤侵袭转移中起关键作用，也可作为酶响应荧光探针的有效触发因子，通过酶切实现局域化荧光信号的释放。此外，肿瘤微环境具有明显的氧化还原失衡，表现为活性氧(ROS)水平升高及还原分子如谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶和硫氧还蛋白还原酶的积累。这些氧化还原差异可被具有特定结构的探针感知，从而实现荧光开关或可控药物释放。最后，肿瘤代谢异常，如三磷酸腺苷(ATP)水平升高与局灶性缺氧，不仅调控肿瘤细胞存活与增殖，也为响应型探针提供了多种激活信号。例如，缺氧可触发缺氧响应探针的激活，而升高的ATP水平则可通过ATP依赖性探针进行检测，实现精准的功能释放。综上，肿瘤内的酸性微环境、酶过表达、氧化还原失衡及代谢失调，构成了高特异性、多刺激响应荧光探针理性设计的基础，并支撑了精准肿瘤诊疗的发展。

2.2 荧光激活机制

可激活分子荧光探针的核心特征是具备刺激响应的可控光学信号，实现可切换成像，其中荧光“关-开”响应是最具代表性的机制之一。这种可切换激活策略不仅显著提高信噪比，还能实现精确的肿瘤定位与实时动态监测。除直接结构激活外，能量转移调控是可激活荧光探针中另一广泛应用的机制，主要包括光诱导电子转移(PET)和荧光共振能量转移(FRET)。在基于PET的探针中，刺激通过抑制或触发电子转移来调节荧光；而在FRET系统中，微环境驱动的能量转移供体-受体变化可实现荧光开关或强度调节。具体而言，PET涉及电子从电子给体转移至激发态荧光团，形成竞争性的非辐射衰变路径，从而抑制荧光发射。当给体与荧光团空间接近且能级匹配时，PET过程占优；而与特定蛋白受体结合可诱导空间分离，从而有效阻断PET过程。这一策略已被广泛用于疾病相关靶点的识别。相反，也有研究开发了基于PET的探针，其通过化学反应（如与硫醇或甲基乙二醛的反应）调节体系的电荷分布，从而激活荧光发射。例如，硫醇诱导的硝基苯磺酰基裂解破坏了PET通路，恢复了硼二吡咯(BDP)荧光团的荧光，其发射受分子内电荷转移(ICT)过程调控；同时，邻苯二胺与甲基乙二醛反应形成的弱给体喹喔啉单元破坏了PET过程，从而使NI-MQL从局域激发态发光。此外，肿瘤过表达的氨肽酶N(APN)可用于位点特异性激活，实现高效的化学-光疗协同肿瘤诊疗。FRET涉及激发态供体通过偶极-偶极耦合将能量非辐射地转移至邻近的受体。通过利用聚集诱导发光(AIE)活性分子TCM-N与七甲川花菁染料Cy的光谱重叠，构建了TCM-N&Cy&Fe@P纳米颗粒，实现了高效的FRET与体外近红外(NIR)发射。得益于其稳定的可见光吸收，TCM-N&Cy&Fe@P在临床肺癌标本中实现了高对比度的肿瘤边界近红外描绘，并通过苏木精-伊红(H&E)染色得到验证。在肿瘤微环境中，热力学驱动的纳米探针解组装破坏了FRET过程并解除荧光猝灭，同时限制了TCM-N的分子内运动从而激活AIE效应。AIE是指某些发光体在分散状态下发射微弱，而聚集时因分子内运动受限、非辐射衰变路径被抑制而表现出显著增强荧光的发光现象。重要的是，在该研究中，基于AIE的成像可清晰地区分患者样本中的肿瘤组织与邻近正常组织。这些机制共同在复杂的生物环境中提供了精确的分子层面控制与高特异性响应。此外，分子构象调控也是可激活荧光探针的重要设计策略。在外部刺激下，肽或染料基分子可发生构象折叠、解组装或自组装，导致AIE效应增强或与解聚相关的显著荧光变化。这种基于结构重排的响应机制不仅赋予可调光学特性，还通过自组装延长局域滞留并放大成像信号，为精准肿瘤诊疗提供了强有力的功能支持。综上所述，荧光“关-开”激活、能量转移调控及刺激触发的构象与聚集状态转变，是基于肽的可激活分子荧光探针实现肿瘤微环境特异性成像的三大基本机制，为其理性设计与性能优化提供了坚实的理论基础。

2.3 肽单元

肽作为可激活分子荧光探针中的关键功能单元，在疾病诊疗中发挥多重作用。作为靶向模块，肽序列能以高亲和力结合肿瘤特异性受体、血管内皮或肿瘤微环境中的分子标志物，实现探针的精确定位与富集。例如，RGD、NGR、GTI和AHNP等肽可选择性结合整合素受体、肿瘤血管特异性受体、前列腺特异性膜抗原及人表皮生长因子受体2(HER2)，从而显著提高肿瘤成像与治疗的靶向效率。尽管某些肽并非肿瘤特异性，如靶向肌动蛋白的Lifeact肽可在肿瘤细胞中高分辨率可视化与细胞迁移和侵袭相关的细胞骨架动态，凸显了其在肿瘤细胞胞内成像中的实用性。其次，肽可作为响应触发模块，在肿瘤特异性酶切、特定pH、缺氧或异常代谢条件、免疫相关肿瘤特征或氧化还原环境下发生裂解或构象变化，从而实现荧光信号或药物载体的可控激活。最后，肽可作为结构-功能一体化模块，通过自组装或构象调控引导纳米颗粒、纳米纤维或其他聚集结构的形成，增强肿瘤局域滞留、信号放大及载药能力，从而促进肿瘤特异性诊疗。整合靶向识别、响应激活与结构组织的可激活肽基分子探针，在实现协同识别-响应行为的同时，提升了探针的稳定性、可控性及与多模态应用的兼容性。

3 基于肽的分子荧光探针的功能类别

3.1 靶向肽基分子荧光探针

靶向肽是基于肽的分子荧光探针中实现肿瘤特异性识别的关键功能单元。通过与肿瘤细胞表面抗原、血管特异性受体或肿瘤微环境内的生化组分高亲和力结合，它们促进探针的精确定位与富集，显著提高成像的空间准确性。胃泌素释放肽受体(GRPR)在正常胰腺组织与胰腺癌细胞中的表达水平相当，但在胰腺导管腺癌中主要定位于肿瘤细胞膜，使其成为肿瘤特异性成像的有效靶点。Gu等人设计并优化了一种新型靶向肽GB-6，可高效结合肿瘤微环境中的GRPR，实现了胰腺癌的快速诊断。所设计的基于肽的近红外荧光探针MPA-PEG₄-GB-6在体内外近红外荧光成像中均显示出在GRPR阳性SW1990人胰腺癌异种移植瘤中的显著且持续的肿瘤富集。两种探针均在注射后1小时内实现快速肿瘤定位，并在6小时达到信号峰值。阻断实验与阴性对照进一步证实肿瘤靶向是由GB-6通过GRPR相互作用介导的特异性过程。与其他探针相比，MPA-PEG₄-GB-6在肿瘤与正常组织之间显示出更高的信背比，尤其是在肿瘤/胰腺和肿瘤/肠道比值方面，凸显了其卓越的肿瘤选择性成像能力。相比之下，MPA-PEG₄-BBN_7-14虽然在胰腺和肠道中摄取相对较高，但在胰腺癌异种移植瘤中产生明显更弱的信号，限制了其区分肿瘤组织与正常胰腺的能力。这些观察结果表明，基于GB-6的探针在GRPR阳性胰腺癌的高特异性成像中具有显著优势，而BBN_7-14作为GRPR激动剂，优先靶向胰腺组织而不具备肿瘤特异性鉴别能力。因此，MPA-PEG₄-GB-6在原位胰腺癌模型中表现出快速成像、长信号滞留和高肿瘤特异性，能有效区分复杂胰腺解剖结构中的肿瘤组织与正常胰腺，并提供高肿瘤/胰腺对比度，强调了其在原发性胰腺癌精准诊断和术中导航中的潜力。此外，MPA-PEG₄-GB-6在注射后1小时内即可在肝转移灶产生可检测的荧光信号，并在4小时达到峰值，表明其具备快速检测和实时识别胰腺癌肝转移的能力。离体荧光成像结合明场观察显示，肝脏中的点状强荧光与转移结节精确对应，并经H&E染色证实。这些结果共同证明，MPA-PEG₄-GB-6能够实现肝转移的实时可视化，并为病理确认和术中决策提供可靠支持。经典的肿瘤靶向肽，连同其靶受体、序列和主要适应症，为肿瘤靶向分子荧光探针的理性设计提供了指导。天然亲水性肽基荧光探针通常分子量小、扩散快、生物相容性好，可实现快速成像响应和高效组织穿透。然而，其循环时间短、肾脏清除快，往往限制了肿瘤富集，导致信号强度和成像持续时间降低。此外，小分子体系缺乏有效的信号放大机制，因为荧光主要来自单分子发射，易受背景干扰。其在复杂生理环境中的稳定性及对酶降解的抵抗能力也有限，进一步影响靶向效率。相比之下，纳米颗粒基探针表现出延长的循环时间和增强的被动靶向能力，同时通过多价相互作用和高负载能力实现信号放大，从而提高成像灵敏度和对比度。总之，肽序列长度、空间构象和密度等因素会影响结合效率和信号强度。因此，荧光探针的设计必须平衡靶向性能和光学特性，以实现高特异性和高对比度的肿瘤成像。

3.2 响应肽基分子荧光探针

3.2.1 酶响应荧光探针

酯酶广泛分布于消化系统、肿瘤组织和多种代谢相关器官中，参与脂质和小分子酯的水解。其表达水平和酶活性的变化与肿瘤发生发展及代谢紊乱密切相关。由于酯酶特异性裂解酯键的能力，其在代谢过程中发挥关键作用，包括前药激活、靶向给药、解毒和探针激活。值得注意的是，在荧光探针体系中，最广泛的应用之一是通过去保护或自牺牲反应触发荧光恢复，实现生物过程的精准成像。Zhang等人设计了一种近红外荧光-光声双模态探针QHD-CE，其中的酯键可被羧酸酯酶(CESs)选择性水解，随后发生1,6-消除，恢复给体-π-受体结构，从而使探针从猝灭状态转变为激活状态。这一转变伴随着荧光恢复和光声信号增强，实现了CES活性的快速可视化检测。此外，Zhou等人通过将酯酶响应基团引入溶酶体靶向红色荧光探针，该探针中的酯键可被多种酯酶广谱水解，并通过增强的ICT效应实现荧光激活。此外，将氨基酸或短肽基序整合到探针设计中，不仅保留了酯键响应机制，还赋予了增强的分子识别特异性和可调性。Ge等人通过在近红外荧光探针中引入二肽底物序列，实现了对脯氨酰内肽酶(PREP)的特异性识别和酶触发荧光激活，从而在小鼠模型中实现了帕金森病相关酶活性的时空可视化。这一策略凸显了短肽在赋予荧光探针高选择性方面的关键作用，并为整合肽识别基序与功能探针、实现癌症等疾病精准诊疗建立了通用设计原则。与此一致，Yu等人开发了一种用于选择性检测羧酸酯酶2(CES2)的近红外双光子荧光探针。在该设计中，引入了可被CES2选择性水解的甘氨酸衍生酯键作为“开关”，酶切触发ICT过程，实现对肿瘤组织的时空诊断，并为结肠癌的精准诊疗提供了可能。与氨基酸或二肽不同，将能被目标酶选择性识别和裂解的肽序列整合到荧光探针中，可使探针在肿瘤区域富集后，通过酶介导的反应诱导显著的构象变化。这些结构转变进而引发显著的荧光增强，实现高特异性肿瘤成像。Feng等人开发了一种可激活的三齿形荧光肽探针RMN，靶向卵巢癌过表达的N-钙黏蛋白，并被肿瘤分泌的MMPs裂解，从而恢复荧光并指导卵巢癌的精准手术切除。Pei等人设计了一种自报告比率型AIE肽探针TPE-1(Hyd-DOX)-DEVD，其中DEVD连接子被半胱天冬酶-3(caspase-3)裂解诱导形态转变和荧光比率增强，实现了肿瘤化疗疗效的无创监测。值得注意的是，肿瘤微环境以多种蛋白酶的异常过表达和活性升高为特征，为酶响应肽基荧光探针的选择性激活提供了内在生物学触发因素。Hu等人设计并合成了一种可被肿瘤相关ALP特异性裂解的肽CPSA，触发肿瘤部位的原位自组装，实现精准药物释放和增强抗原呈递。此外，Zhang等人开发了ALP调控的动态液-液相分离(LLPS)系统，成功构建了肽凝聚层逻辑门和可编程信号转导平台。通过酶触发裂解或对特定化学基团的响应实现多模态肿瘤成像，已成为近年来肽基分子荧光探针的研究重点。Ye等人开发了一种肿瘤预靶向治疗策略，整合了级联ALP介导的原位自组装与生物正交反电子需求狄尔斯-阿尔德(IEDDA)反应，以实现多模态成像引导的光动力治疗(PDT)。具体而言，ALP催化含反式环辛烯(TCO)的P-FFGd-TCO去磷酸化，触发其原位自组装成膜靶向纳米颗粒FMNPs-TCO，作为肿瘤细胞膜上的“人工抗原”。通过快速的IEDDA反应，这些FMNPs-TCO选择性捕获四嗪(Tz)修饰的光敏剂775NP-Tz和碳酸酐酶(CA)抑制剂SA-Tz，诱导FMNPs-775/SA纳米颗粒在肿瘤细胞膜上原位再生。这一过程通过持续抑制CA活性和缓解肿瘤缺氧，增强了PDT疗效。结果显示，FMNPs-775/SA通过IEDDA反应发生纳米颗粒交联和再生，同时保持强顺磁性和双近红外荧光，从而实现双模态荧光/磁共振成像。阴性对照实验证实，纳米颗粒再生依赖于FMNPs-TCO与775NP-Tz之间的特异性交联，而非单个组分的自发自组装。细胞实验表明，用P-FFGd-TCO孵育的HeLa细胞在细胞膜上产生明显的绿色荧光、710 nm处的强近红外发射及增强的T₁加权磁共振信号，进一步证实了P-FFGd-TCO的特异性膜富集和ALP介导的原位自组装。相比之下，对照组信号明显较弱，证实了该策略在实现探针靶向富集和多模态成像方面的有效性。体内荧光成像显示，在P-FFGd-TCO预靶向后，HeLa皮下异种移植瘤中mCy和NIR775的荧光信号在注射后1小时内迅速升高并保持高水平，显著优于无预靶向或用P-Gd-TCO处理的对照组。相应的磁共振成像结果显示，预靶向肿瘤的T₁加权信号增强更为持久，最大增幅约为62%，甚至在16小时后仍保持在约52%，显著高于对照组。这些发现表明，原位自组装与生物正交IEDDA反应的结合，有效延长了荧光和磁共振成像探针在异种移植瘤内的滞留时间。ALP响应肽基分子荧光探针目前在选择性肿瘤富集和信号放大方面已取得显著进展，突显了其在精准肿瘤成像中的前景。尽管酶响应肽基荧光探针在分子和纳米结构层面均能实现肿瘤特异性成像，但其在体循环中的稳定性仍是关键挑战。为解决非特异性蛋白酶降解引起的过早解离和假阳性信号风险，未来的努力应集中在三个关键方向。首先，在分子工程层面，可通过引入非经典氨基酸、环状肽结构或化学屏蔽基序来增强可裂解连接子的抗血清蛋白酶能力，同时保持肿瘤特异性响应性。其次，在纳米结构设计层面，构建共价整合、结构稳健的纳米组装体、酶响应水凝胶封装系统或自报告纳米颗粒平台，可提高结构稳定性和时空可控激活能力。第三，仿生策略，包括细胞膜伪装、高密度脂蛋白(HDL)样载体或外泌体模拟囊泡，可有效减轻蛋白冠形成和补体识别，从而增强体内生物相容性和稳定性。同时，应采用先进的验证方法，包括人血清稳定性分析、微流控循环系统和人源化蛋白酶小鼠模型，定量评估连接子降解半衰期和信号泄漏指数。通过协同整合“循环隐身”、“抗裂解稳定性”和“肿瘤激活响应性”，这些策略有望从根本上减少非特异性降解引起的假阳性信号，加速分子和纳米尺度肽基荧光探针的临床转化。

3.2.2 缺氧响应荧光探针

肿瘤微环境的缺氧为缺氧响应肽基荧光探针的开发提供了天然触发因素。将缺氧可还原基团（如硝基、偶氮或吡啶基团）引入肽骨架或荧光团中，可使这些探针在定位到肿瘤缺氧区域时发生化学还原或键裂解。这种缺氧触发的转变诱导探针构象变化，从而激活荧光信号或调节自组装行为，最终实现高信噪比的局域成像。受天然组氨酸咪唑基团和硝基还原酶(NTR)响应硝基咪唑特性的启发，Yu等人设计并合成了一种NTR响应的非经典氨基酸来调节肽的自组装。具有不同序列的芳香三肽在NTR介导的还原前后，在构象和自组装纳米结构上表现出显著差异。Fmoc-A(2NI)IE肽在NTR处理前后均保持β-折叠构象和纳米纤维形态，表明其组装行为稳定。相反，Fmoc-A(2NI)VE在NTR还原后发生了从有序纳米纤维到纳米颗粒的明显形态转变，表现出显著的NTR响应性。同时，Fmoc-A(2NI)AE保持无规卷曲结构而无明显聚集。原子力显微镜和透射电子显微镜分析一致表明，肽序列中第二个残基的疏水性在NTR响应条件下对构象转变和组装行为的调控起着关键作用。进一步研究表明，通过将Fmoc-A(2NI)VE与IR780共轭获得的肽基荧光探针，在NTR还原后发生纳米结构转变，伴随IR780荧光从猝灭态向发射态的转变。这些结果凸显了整合芳香肽可实现NTR触发的自组装，实现形态与功能的协同调控，并促进具有响应性、选择性和形态可转换性的超分子探针的构建。体内实验进一步揭示，FI-A(2NI)VE探针能有效富集于缺氧肿瘤区域并产生强荧光信号，而在用还原产物FI-A(2NH₂I)VE处理或联合给予NTR抑制剂的小鼠中，荧光显著减弱。冷冻切片共聚焦激光扫描显微镜成像进一步证明，FI-A(2NI)VE即使在肿瘤深部区域也能产生明显的荧光信号，表明其具有良好的肿瘤穿透能力和选择性NTR响应激活。该策略展示了利用非经典氨基酸调控肽自组装和功能成像的潜力，为缺氧相关肿瘤诊断和先进生物材料的开发提供了新见解。缺氧响应设计不仅提高了肿瘤特异性，还能在独特的微环境条件下精确控制探针动力学和滞留。近年来，多刺激响应策略越来越多地被应用于缺氧响应探针，通过整合缺氧、酶或黏度响应性，实现信号放大和精准激活，进一步提高肿瘤靶向成像性能。

3.2.3 pH响应荧光探针

肿瘤组织呈现反向pH梯度，即细胞内pH相对中性（~7.2–7.4），而细胞外微环境呈酸性（~6.5–6.9），这为pH响应探针的设计提供了关键依据。将可质子化氨基酸残基或酸不稳定键引入肽骨架或荧光团中，可使pH响应肽基分子探针在进入酸性肿瘤区域时发生质子化或键裂解。除提高肿瘤靶向精度和调节探针动力学外，pH响应设计还能显著降低背景信号，为精准癌症诊疗提供多功能平台。Xiao等人开发了一种单链胶原模拟肽探针TEMPO，具有敏感的pH可激活特性，能够高特异性识别肿瘤细胞外基质(ECM)。TEMPO探针通过对Pn-m肽系列进行筛选获得，序列为(Gly-Pro-Hyp)₃-(Gly-Amp-Pro)₄-(Gly-Pro-Hyp)₃，整合了稳定的三螺旋单元和pH响应性失稳片段。显色分析表明，Dy-P0-8肽在pH 7.6–6.2范围内保持无色，表明其pH敏感性可忽略；而Dy-TEMPO表现出明显的pH响应行为，在pH 6.8至6.6之间从浅绿色转变为橙色。此外，用吲哚菁绿(ICG)或Gd-DOTA标记的TEMPO探针可实现肿瘤ECM的体内近红外荧光和磁共振成像。体外研究证实其具有优异的生物相容性，在荷瘤小鼠模型中，ICG-TEMPO特异性富集于肿瘤部位，注射后3小时荧光达到峰值，并显著超过其他器官的信号，证明了其精确的肿瘤靶向能力。Gd-TEMPO肽探针的磁共振成像性能显示，随着Gd³⁺浓度的增加，T₁加权信号显著增强，在1.0 T磁共振成像系统中纵向弛豫率为3.41 mM^?1s^?1。注射后6小时，Gd-TEMPO在肿瘤部位产生明显的T₁加权信号增强，进一步验证了其在肿瘤多模态成像中的潜力。总体而言，TEMPO探针利用pH诱导的构象变化实现了肿瘤ECM的高特异性多模态成像，为跨肿瘤类型的早期精准诊断和靶向治疗提供了新的分子工具。未来pH响应肽基荧光探针的发展应优先考虑整合多刺激激活（如pH、酶和缺氧），以克服单一pH梯度带来的特异性限制，实现精准肿瘤激活。同时，合理控制分子和纳米尺度的构象动力学和自组装对于信号放大和延长滞留至关重要。特别需要注意的是，应通过结构屏蔽和仿生策略增强循环稳定性并最小化非特异性激活。最后，向临床相关场景的转化需要在小动物以外的复杂生理模型中进行严格验证，以确立真实肿瘤微环境中的成像可靠性。该策略不仅能显著提高探针的特异性和对比度，还为复杂肿瘤微环境的动态监测和可控干预提供了框架，代表了开发“智能”和可编程肽基响应荧光探针的关键一步。

3.2.4 氧化还原响应荧光探针

肿瘤微环境常表现为明显的氧化还原失衡，体现为ROS水平升高和还原性分子GSH浓度异常升高。利用这些特征，氧化还原响应肽基荧光探针通过ROS敏感或GSH可裂解基团实现可控信号激活或功能释放。ROS响应探针通常在肽骨架中引入易被过氧化氢或过氧化物等活性物质氧化的官能团，包括硫醚、硫醇或硝基取代残基。在肿瘤高ROS条件下，这些基团发生氧化，触发荧光开关或分子构象重排，实现高信噪比的局域成像。GSH响应探针则通常采用二硫键、硫醚或其他化学可还原连接子将荧光团连接到肽骨架上。在肿瘤细胞内，高浓度GSH可诱导化学键裂解或分子构象重组，从而激活荧光信号并实现还原性肿瘤微环境的可视化。例如，Fan等人通过模块化整合荧光团核心、GSH响应连接子、PEG亲水链和RGD靶向单元，构建了一种GSH可激活的靶向近红外二区荧光探针Tg-RGD，兼具高水溶性和肿瘤选择性。在无GSH条件下，荧光被有效猝灭；而肿瘤微环境中过表达的GSH触发二硫键裂解和分子内重排，导致显著的近红外二区荧光激活。靶向富集与刺激响应激活的协同作用使该探针对肝转移灶实现高信噪比成像，体现了“靶向-响应-结构一体化”策略在转移性肿瘤精准成像中的优势。在乳腺癌原位小鼠模型中，Tg-RGD和对照Tg-PEG在注射前背景信号极低，而Tg-RGD在给药后短时间内即在肿瘤部位产生强近红外二区荧光信号，显示出快速的体内成像能力和高对比度。在乳腺癌模型验证后，Tg-RGD进一步应用于原位骨肉瘤模型。结果显示，Tg-RGD通过近红外二区荧光在体内清晰描绘了骨肉瘤病灶，在注射后24小时实现显著的肿瘤富集，荧光强度明显高于肝脏。离体生物分布和组织学分析进一步证实了Tg-RGD的高肿瘤靶向特异性和生物相容性，凸显了其在多种原位肿瘤模型中的近红外二区成像潜力。鉴于骨肉瘤病灶的近红外二区信号高于肝脏，Tg-RGD随后在肝转移模型中进行评估。结果显示，Tg-RGD在转移灶产生强荧光，而对照Tg-PEG几乎无富集，信背比显著提高。组织学分析证实高荧光区域对应于肝转移灶，证明了Tg-RGD对小转移灶的优异检测能力。总之，可激活的近红外二区肽基分子探针Tg-RGD在GSH激活下表现出显著的荧光增强，具有优异的靶向能力和体内成像性能。该系统为设计多功能、高性能的近红外二区荧光探针用于早期肿瘤诊断、侵袭评估和疗效监测提供了参考。此外，氧化还原微环境的变化会加速神经退行性过程并促进Tau等蛋白的聚集。尽管肽基Tau靶向配体面临跨越血脑屏障的挑战，但结合受体介导的转胞吞与靶向蛋白降解的双功能分子研究提供了一种模块化策略来克服这一限制。这一概念为多功能肽基荧光探针的设计提供了宝贵见解，实现了分子识别、屏障转运和环境响应信号的整合，从而促进精准脑部成像，并可能在未来扩展到脑肿瘤靶向应用。

3.2.5 肿瘤免疫响应荧光探针

肿瘤免疫响应分子荧光探针是一类能够在肿瘤免疫微环境中选择性激活发光信号的智能探针。其设计基于免疫细胞活性、蛋白酶或细胞因子的动态变化。这些探针通常在静息状态下保持低背景信号，仅在与肿瘤免疫相关触发因子相互作用时才表现出显著的荧光或其他可检测信号，实现高信噪比的实时成像。例如，Pu等人开发了一种靶向肿瘤相关自然杀伤(NK)细胞(TANKs)的可激活荧光/光声大分子探针。通过识别这些细胞中过表达的特异性蛋白酶，该探针实现局域“开启”信号，从而在体内动态监测免疫细胞分布和功能状态。BhCyNK探针在静息条件下保持猝灭状态，而TANKs中过表达的颗粒酶A(GzmA)裂解则恢复ICT效应，导致荧光和光声信号显著增加，从而特异性反映免疫细胞活性。BhCyNK_M在多种小鼠细胞类型（包括4T1肿瘤细胞、中性粒细胞、骨髓来源巨噬细胞和CD4⁺及CD8⁺T细胞）中进行了评估。结果显示，NK细胞中的近红外荧光和光声信号显著增强（分别为4.4倍和4.2倍，相较于4T1细胞），且信号增强与NK细胞特异性GzmA过表达密切相关。抑制GzmA使信号降至与肿瘤细胞相当的水平，明确证明BhCyNK_M的信号放大源于NK细胞特异性酶活性，凸显了其作为肿瘤免疫响应分子探针的潜力。此外，BhCyNK_M能够动态监测接受不同治疗方案小鼠的瘤内近红外荧光和光声信号。在Oxa/aPD-L1联合治疗组中，信号显著增强，并与TANK(NKp46⁺CD49b⁺)浸润水平高度相关。信号的空间分布与GzmA活性共定位，表明BhCyNK_M可以无创、实时地报告肿瘤免疫反应，并可能作为免疫治疗疗效的预测工具。总之，与传统靶向分子荧光探针相比，该策略不仅能监测TANKs的空间分布，还能评估肿瘤免疫治疗效果，为肿瘤免疫响应分子探针的设计提供了有力范例。随着对肿瘤免疫微环境认识的不断深入，越来越多的由酶、细胞因子或代谢状态触发的探针被开发出来，为肿瘤免疫功能成像和多模态诊疗提供了新机遇。值得注意的是，目前评估肿瘤免疫治疗的策略主要集中在T细胞的存在而非其功能活性，这限制了对治疗效果的准确评估。活化的免疫细胞通过释放关键效应蛋白（包括颗粒酶B(GzmB)）发挥对肿瘤细胞的细胞毒性作用。在此背景下，开发能够定量检测GzmB的生物活性功能肽基成像造影剂，在精准评估免疫治疗结果方面具有相当大的前景。Feng等人开发了一种红细胞(RBC)“搭便车”的三齿形可激活荧光肽探针，免疫原性降低，集延长体循环、酶响应激活和肿瘤靶向能力于一体，用于卵巢癌的精准术中成像。该探针包含N-钙黏蛋白靶向肽、MMP-2/9可裂解连接子和荧光团-猝灭剂FRET对，在肿瘤微环境中经酶切后实现荧光“关-开”激活。同时，引入RBC结合肽显著延长了血液循环时间并增强了肿瘤富集。到达肿瘤部位后，MMP介导的裂解恢复荧光并释放靶向片段，从而实现对N-钙黏蛋白过表达肿瘤细胞及其转移灶的高信噪比识别。与此同时，Yuan等人关注肿瘤免疫微环境的调控，报道了一种在肿瘤相关巨噬细胞中选择性激活的组织蛋白酶B(CTSB)可激活光敏剂前体(NP-YB-5)。通过利用M2巨噬细胞中CTSB的过表达，酶切触发I型光敏剂的释放，实现高效ROS生成。该过程诱导巨噬细胞从促肿瘤的M2表型重编程为抗肿瘤的M1表型，从而缓解免疫抑制性肿瘤微环境。值得注意的是，酶响应激活、荧光成像和光免疫治疗的整合凸显了其作为克服药物诱导肿瘤免疫抑制的诊疗平台的潜力。这些研究共同表明，未来肿瘤免疫治疗中的肽响应策略将日益强调多维精准调控和功能整合。一方面，针对肿瘤微环境线索（如酶、pH和ROS）进行工程设计的高响应肽底物，可实现免疫相关过程的时空可控激活，从而提高治疗选择性并最小化全身毒性。另一方面，与先进递送策略（如RBC搭便车）和靶向配体的整合，有望进一步优化体内性能，实现延长循环、增强肿瘤富集和深层组织穿透。更重要的是，未来的努力可能会集中在将肽响应机制与免疫细胞重编程、免疫检查点调控和多模态治疗（光疗、声疗和化疗）相结合，构建统一“精准感知-信号放大-免疫激活”的一体化诊疗平台，从而为克服肿瘤免疫抑制和改善整体治疗效果提供更大潜力。响应肽基分子荧光探针通过精确识别肿瘤微环境中的特定刺激实现可控信号激活，涵盖酶响应、pH敏感、氧化还原响应、缺氧响应和免疫响应等多种模式。其主要优势在于高选择性、低背景信号以及动态反映肿瘤或免疫细胞状态的能力，从而为疾病早期诊断和治疗评估提供无创工具。然而，由于信号激活通常依赖于局域微环境线索或单一刺激，这些探针在信号强度、体内稳定性和组织分布方面可能存在局限性。肽的可编程结构能够实现构象变化和自组装，这不仅放大了响应信号，也为在体内外构建一体化的肿瘤特异性分子荧光探针奠定了基础。虽然部分响应肽基荧光探针在激活过程中本身就涉及肽自组装，但对集成肽探针的机制基础进行系统分析和讨论，对于推进增强型肿瘤诊疗的发展至关重要。

3.3 集成肽基分子荧光探针

3.3.1 体外组装肽基探针

体外组装肽基分子荧光探针可通过肽分子的可编程设计进行精确构建。通过调节肽序列、疏水/亲水比例、静电相互作用以及pH、离子强度或温度等外部刺激，这些探针可在受控条件下形成纳米纤维、球形纳米颗粒或其他有序纳米结构，从而增强荧光信号。自组装不仅提高了探针的量子产率和光稳定性，还提供了适合后续体内应用的定义明确的尺寸和形态，实现稳定循环、增强靶向和多模态成像。例如，Song等人开发了一种结合热激活延迟荧光机制的刚性α-螺旋肽纳米探针，实现了时间分辨的高对比度生物成像。Yan等人设计了结合2-脱氧-D-葡萄糖和近红外染料的肽纳米颗粒，通过ATP抑制介导的肿瘤饥饿效应，协同增强温和光疗，实现一体化近红外诊疗。总之，肽基分子荧光探针的体外自组装不仅为研究其动力学和光学行为提供了结构可控的纳米尺度模型，还为构建高性能响应探针和实现精准肿瘤成像奠定了分子基础。

3.3.2 原位组装肽基探针

肽基分子荧光探针的原位组装不仅能增强探针滞留，还能通过调节分子间相互作用实现信号放大。其中，聚集诱导发光(AIE)效应是应用最广泛的机制之一。在分散状态下，AIE分子因自由旋转或振动而荧光猝灭；而在组装或聚集状态下，分子运动受限，猝灭被抑制，荧光强度显著增强。Wang等人开发了一种Zn²⁺响应AIE“关-开”荧光探针，可在细胞内经Zn²⁺触发发生原位自组装，实现高灵敏度Zn²⁺检测和成像。此外，J-聚集体是通过特定的头对尾分子排列形成的有序组装体。分子间的激子相互作用导致窄带红移发射和荧光增强。这种有序聚集体不仅增加了光学信号亮度，还可以通过调节堆积模式和分子间距离来实现发射波长调谐，促进深层组织成像应用。受此启发，Xu等人设计了在肿瘤细胞膜上自组装的可激活肽，用于高效膀胱癌识别。TRAP肽基荧光探针可在膀胱癌病灶上原位自组装成纤维纳米网，实现长期滞留和精准成像。TRAP系统经历三步级联：靶向肽识别CD44v6膀胱癌标志物；反应诱导聚集肽发生快速无试剂点击化学反应；最终形成超分子纳米纤维网络。这种原位组装的纤维网络不仅确保了肿瘤特异性，还因高度有序的空间排列显著增强了光稳定性。TRAP探针在膀胱肿瘤中表现出优于P1-FITC和RAP的荧光，即使长时间激光照射（1–4小时）后仍保持可见荧光，显示出优异的体内光稳定性。相比之下，RAP因缺乏靶向性仅显示微弱的肿瘤荧光，而P1-FITC荧光随时间显著衰减。此外，TRAP在人膀胱癌组织中表现出高特异性和灵敏度，肿瘤荧光约为正常组织的五倍。与传统P1-FITC探针相比，TRAP不仅增强了信号强度，还清晰描绘了肿瘤边缘，实现了高空间分辨率成像。这些结果表明，TRAP系统在术中成像和手术导航方面具有显著潜力。重要的是，通过精确设计肽序列和化学修饰，可以制备具有可控尺寸、形态和光学性质的凝聚层，实现荧光信号增强和及时调控。例如，Song等人将AIE发光体与共相分离肽共轭，形成肽凝聚层，激活荧光用于肿瘤细胞内的高对比度RNA成像。通过精确的肽序列设计，Jokerst等人实现了蛋白酶触发的肽自组装和纳米颗粒聚集的比色传感，为合理设计可有效整合到肿瘤生物分子凝聚层中进行精准肿瘤成像的荧光探针提供了启示。具体而言，Tan等人开发了用于选择性、便捷、实时监测肿瘤细胞中典型生物分子凝聚层——应激颗粒蛋白及其动态进程的小分子探针TASG。由于其对抗生物分子凝聚层的高亲和力，肽无疑是构建下一代靶向探针的基本构件。因此，原位组装提供了信号放大、改善空间分辨率和对比度以及增强肿瘤滞留的优势，为早期诊断、术中导航和治疗监测提供了可靠工具。

3.3.3 优势与挑战

自组装肽荧光探针通过肿瘤微环境触发的原位聚集，在成像稳定性和信号持久性方面实现了显著增强。与单分子探针相比，自组装结构有效抑制了荧光猝灭并延长了局域滞留，在较长时间内维持肿瘤区域的高光学信号强度。这一特征支持从早期诊断、术中导航到治疗监测的一系列应用。此外，自组装结构能够共负载药物或光敏剂，增强诊疗功能，为精准肿瘤学提供多重优势。然而，自组装探针在临床转化中面临若干潜在挑战。首先，纳米尺度组装体可能影响体内代谢和排泄，长期