全合成仿生聚硫酸盐的可调控抗凝与内皮细胞选择性生物活性

《Macromolecular Bioscience》：Fully Synthetic, Biomimicking Polysulfates With Tunable Anticoagulant and Endothelial Cell–Selective Bioactivity

　　

研究人员展示了一种用于制备糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG）启发的聚电解质刷涂层的通用方法，该涂层由全合成的磺化聚（2-羟基乙基甲基丙烯酸酯）（poly(2-hydroxyethyl methacrylate), PHEMA）嵌段共聚物制备而成。采用生物惰性骨架可在独立于天然GAG碳水化合物骨架的情况下评估磺化效应。磺化度（degree of sulfation, DS）超过70%时赋予抗凝活性，在0.1 mg mL^?1浓度下将血浆凝固时间延长至超过500秒。可控自组装实现了在聚苯乙烯（polystyrene, PS）基底上均匀纳米级薄刷的制备与光固定。聚硫酸盐刷表现出分子量依赖性特性：在无血清条件下，与较短的P1-OSO₃-BP（15 kDa）相比，更长的P2-OSO₃-BP（65 kDa）刷选择性促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）增殖，而平滑肌细胞（smooth muscle cells, SMCs）保持静止。尽管血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）表面密度相当（0.5 ng cm^?2），P2-OSO₃-BP涂层更好地保持了VEGF生物活性，可能归因于更高的链柔性。在含血清条件（5%）下的共培养中，HUVEC/SMC比值保持接近1并持续共定位，表明SMC过度生长受到抑制且血管共培养体系趋于稳定，这与预防新生内膜增生相关。这些发现突出了合成聚硫酸盐刷涂层作为研究磺化驱动生长因子相互作用和生物材料界面血管细胞竞争平台的潜力，促进体外再内皮化。该系统因此代表了GAG的功能模拟物，重现关键静电特征的同时避免了天然多糖的结构复杂性。

**研究背景与问题提出**

糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAGs）如硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素是线性高电荷多糖，广泛分布于细胞外基质（extracellular matrix, ECM）和糖萼中，在调节细胞黏附、信号传导、炎症和止血等过程中发挥重要作用。其生物活性主要由硫酸基团和羧酸基团的空间排列与密度所驱动，这些阴离子基团通过静电相互作用与多种蛋白质及细胞表面受体结合。GAG与生长因子的相互作用对血管生成和组织再生至关重要，例如通过碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）和血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A, VEGF-A）介导受体信号传导。然而，天然GAG的生物变异性和生产局限性为其在生物医学研究和临床应用中的安全、可重复及规模化使用带来了显著挑战。

为克服这些局限，合成GAG模拟物——特别是磺化聚合物——已成为有前景的替代方案。这类材料旨在以结构明确、化学稳定的方式重现GAG的多价阴离子特征。尽管现有研究多聚焦于基于糖类的聚合物及其特定磺化模式相关的抗凝和抗病毒活性，磺化聚合物在调控细胞-材料相互作用方面也具有重要潜力。通过模拟硫酸乙酰肝素结合生长因子并将其呈递至细胞受体的能力，这些聚合物可增强体外不同细胞类型的黏附、增殖和分化。对于直接接触血液的材料如血管移植物、支架和导管而言，这种细胞指导能力尤为重要，因为这些材料必须模拟天然血管界面以避免血栓形成、炎症或移植物失效。快速再内皮化——即内皮（祖）细胞在生物材料表面形成功能性融合内皮层的过程——对于恢复屏障功能、减少血小板黏附、抑制凝血及防止SMC过度增殖和迁移至关重要，后者否则将导致新生内膜增生和移植物失效。

**研究设计与核心结论**

基于上述背景，研究人员提出假设：向生物惰性、化学结构简单的聚合物骨架引入高密度负电荷，可在溶液和表面水平上赋予系统GAG样特征。选择聚（2-羟基乙基甲基丙烯酸酯）（poly(2-hydroxyethyl methacrylate), PHEMA）作为模型系统，源于其已知的生物惰性、美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准状态以及丰富的羟基可用于化学转化为硫酸基团。由于未修饰的PHEMA涂层通常不支持蛋白质-表面相互作用或锚定依赖性哺乳动物细胞的黏附，这使得引入负电荷的贡献可被系统评估。

**关键技术方法**

研究人员通过可逆加成-断裂链转移（reversible addition-fragmentation chain-transfer, RAFT）聚合合成HEMA基均聚物和嵌段共聚物，随后进行不同程度磺化以系统调控电荷密度。采用活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time, aPTT）实验评估溶液中的抗凝活性；通过动态光散射（dynamic light scattering, DLS）优化嵌段共聚物的自组装条件；利用石英晶体微天平耗散测量（quartz crystal microbalance with dissipation, QCM-D）验证苯甲酮（benzophenone, BP）介导的表面相互作用；借助光谱椭偏仪（spectroscopic ellipsometry, SE）、静态水接触角（contact angle, CA）和原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）表征涂层特性；通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA）定量生长因子结合；最终开展人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人主动脉平滑肌细胞（SMCs）的单培养和共培养实验评估生物学性能。

**研究结果**

**聚合物合成与表征**：通过RAFT聚合合成目标分子量为10、30和50 kDa的线性PHEMA均聚物（P1-3），以4-氰基-4-(苯基羰基硫代硫基)戊酸（4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid, CPADB）链端片段为参照进行¹H核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）分析，结果显示分子量略高于目标值。凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）分析采用聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate, PMMA）标准品，表观分子量约为理论值的两倍，这与文献中甲基丙烯酸酯类聚合物在二甲基甲酰胺（dimethyl formamide, DMF）中的流体力学体积差异相符。分散度（D）为1.22–1.37，表明聚合控制良好。P1-2的羟基以每目标羟基1.1当量三氧化硫-吡啶复合物（SO₃·py）在干燥DMF中磺化，得到不同DS（30%、70%和100%）的聚硫酸盐P1-OSO₃和P2-OSO₃。新出现的约4.3 ppm ¹H NMR信号对应于磺化后HEMA单元侧链中亚甲基质子的位移，验证了磺化成功。元素分析和NMR积分计算的DS值总体一致，但NMR值偏高，归因于冻干聚合物的吸湿性导致元素分析中硫含量低估。

通过顺序RAFT聚合将P1-3均聚物原位转化为含寡聚苯甲酮（BP）锚定嵌段的PHEMA基嵌段共聚物P1-3-BP。芳族峰积分显示每个锚定嵌段平均含5–7个BP单元。GPC分析显示嵌段共聚物相对于均聚物分子量和分散度略有增加， predominantly unimodal的 weight distributions 及向高分子量的clear shift supports successful sequential polymerization。定量磺化后得到P1-2-OSO₃-BP，其在水溶液中的两亲性质导致胶束形成，其中疏水性MABP嵌段位于 core 而难以被¹H NMR检测。

**抗凝活性评估**：aPTT实验显示，抗凝活性随主链分子量和DS增加而增强，在0.05 mg mL^?1及以上浓度最为显著。所有DS≥70%的磺化PHEMA聚合物在0.1 mg mL^?1时凝固时间均超过500秒（最大观察时间）。未分级肝素（unfractionated heparin, UFH）在10倍低浓度（2 USP mL^?1）即达此效果。含BP锚定嵌段的P2-OSO₃-BP与 comparable backbone molecular weight and DS的P2-OSO₃无显著差异，证实短BP锚定嵌段不影响凝血特性。

**涂层制备与表征**：DLS优化了选择性溶剂条件。P1-OSO₃-BP在所有条件下粒径为5–10 nm，表明单链溶解；P2-OSO₃-BP在水中形成约800 nm聚集体，加盐后降至约30 nm，过滤后进一步降至20–25 nm。QCM-D验证了P3-BP在选择性溶剂中经BP介导的表面吸附，吸附质量为380 ± 20 ng cm^?2，且ΔD位移低表明形成结构更紧凑的刷层。

PS涂层经SE测定干厚度：P1-OSO<sub>3-BP为1.7 ± 0.3 nm，P2-OSO3-BP为2.4 ± 0.1 nm，P3-BP为4.3 ± 0.7 nm。接枝密度分别为0.04 ± 0.01、0.013 ± 0.001和0.08 ± 0.01 chains nm^?2，L/2Rg值均小于1，确认所有涂层处于刷状构象。CA分析显示P2-OSO3-BP（约30°）低于P1-OSO3-BP（约45°），与未磺化P3-BP相近。XPS检测到聚硫酸盐修饰样品的硫信号（S 2p），亚甲蓝染色证实磺化涂层表面硫酸基团的存在和可及性。

AFM显示P1-OSO3-BP刷涂层光滑均匀，与P3-BP相似，全局表面粗糙度为1–2 nm；P2-OSO3-BP涂层则呈现100–150 nm直径、高达20 nm的纳米级表面聚集体，20 μm²大范围扫描显示额外孤立聚集体，但相图低对比度证实涂层均匀覆盖无斑块。

**细胞黏附与增殖**：标准含血清培养条件下，P1-OSO3-BP和P2-OSO3-BP刷涂层支持HUVECs和SMCs的黏附增殖，与组织培养聚苯乙烯（tissue culture polystyrene, TCPS）对照相当。非磺化P3-BP涂层则显著减少黏附细胞数量，HUVECs黏附减少更甚，形成spheroid，而SMCs和HDFs呈isolated cell patches，48小时后几乎无增殖，确认其非允许性表面特性。

无血清培养条件下，P2-OSO3-BP上HUVECs在96小时内显著增殖，表面覆盖率提高，而P1-OSO3-BP和TCPS对照无此效应。SMCs在两种聚硫酸盐刷上均保持静止，呈现elongated contractile phenotype，72小时内表面覆盖率稳定不增。这表明聚硫酸盐刷涂层选择性支持HUVEC而非SMC的黏附增殖，且该选择性被含血清条件掩盖。

**生长因子结合与生物活性**：间接ELISA显示，P1-2-OSO3-BP和TCPS对照均有效结合bFGF和VEGF（上清残留0.2–0.4 ng mL^?1），而非磺化P3-BP结合较弱（1.5 ng mL^?1）。对应表面密度约为0.5 ± 0.1 ng cm^?2。尽管聚硫酸盐刷和TCPS上结合的生长因子数量相当，仅P2-OSO3-BP促进HUVEC显著增殖，提示其更好地保持了VEGF生物活性，可能由于更长更柔性的链构象有利于生长因子活性构象的稳定化。

**共培养实验**：含血清条件（5%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS））下的HUVEC/SMC直接共培养中，两种聚硫酸盐刷涂层上HUVEC/SMC比值接近1并维持72小时，无统计学显著差异。P2-OSO3-BP在48小时显示最高HUVEC/SMC比值，超过TCPS和P1-OSO3-BP。TCPS在72小时出现比值下降，提示内皮细胞生长受抑，而两种聚硫酸盐刷维持比值大于1。与单培养中SMCs 48小时即达融合相比，共培养中SMCs 72小时未达融合，显示竞争条件下SMC增殖受抑。持续共定位证实建立平衡的、类血管的细胞界面而非任一细胞类型的优势扩增。

**脱细胞外基质应用**：将P2-OSO3-BP涂层策略扩展至大鼠主动脉脱细胞外基质（decellularized extracellular matrix, dECM），亚甲蓝染色证实聚硫酸盐刷的成功固定，且一周洗涤后仍保持强着色，表明共价固定而非物理吸附。

**研究结论**

该研究建立了由全合成、无碳水化合物骨架的磺化PHEMA制备聚电解质刷涂层的通用策略。生物惰性FDA批准PHEMA的使用使磺化驱动生物学效应的评估独立于天然多糖骨架的内在生物活性。DS>70%赋予强抗凝活性，0.1 mg mL^?1时血浆凝固时间超过500秒。控制性选择溶剂化产生主要单分散的嵌段共聚物，在PS基底上均匀自组装，经BP光固定后形成纳米级薄刷。所有涂层处于少子刷区，分子量和吸附条件影响厚度和粗糙度。GAG仿生生物活性通过不同细胞类型响应得到证实：血清条件下磺化刷显著增强细胞黏附；无血清条件下仅HUVECs增殖，P2-OSO3-BP上96小时达约60%表面覆盖。两种聚电解质涂层结合相当量VEGF和bFGF（约0.5 ng cm^?2），仅更长P2-OSO3-BP链有效促进内皮增殖，归因于其更大链柔性对VEGF生物活性的关键作用。SMC表面覆盖率恒定，呈收缩表型，与对bFGF的低响应性相关。含血清共培养中SMC扩增受抑，内皮生长后期稳定，两细胞类型持续共定位，维持平衡HUVEC/SMC界面，而TCPS随时间出现内皮不利趋势。这些结果确立了磺化PHEMA刷涂层作为可调合成平台，在明确培养基组成下促进材料界面再内皮化。除生物支架刷功能化的组织工程应用外，未来 exercising 将关注建立和表征不同DS的聚电解质刷，系统测试表面血液相容性，并开展受体激活机制研究，以阐明刷分子量和链柔性如何调控表面结合生长因子的生物活性。</sub>