《ChemCatChem》：Stereoselective Production of Fluorohydrins Biocatalyzed by an Alcohol Dehydrogenase From Pichia glucozyma
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手性氟代醇是重要的不对称有机合成中间体，作为药物化学及相关领域中制备专用含氟材料和生物活性分子的关键结构单元。本研究利用源自Pichia glucozyma的酮还原酶(KRED1-Pglu，ketoreductase)在大肠杆菌(Escherichia col
手性氟代醇是重要的不对称有机合成中间体，作为药物化学及相关领域中制备专用含氟材料和生物活性分子的关键结构单元。本研究利用源自Pichia glucozyma的酮还原酶(KRED1-Pglu，ketoreductase)在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源过表达，研究了其对一系列α-卤代酮的生物还原。研究人员分别使用冻干全细胞制剂和纯化的重组酶作为催化剂，发现纯化酶具有更好的化学选择性，这可能是由于全细胞体系中不存在干扰的内源活性。研究人员分析并优化了反应参数的影响，总体上获得了一系列(R)-氟代醇，具有很高转化率和优异立体选择性（产率62%→99%，对映体过量ee 70%→99%）。值得注意的是，该酶可接受羰基α位单卤代和二卤代底物，也可接受其他基团如（杂）芳香族和脂肪族取代基。
该研究论文发表于《ChemCatChem》。研究背景方面，氟代醇（又称β-氟代醇）是一类重要的有机氟化合物，尤其以其光学活性形式在合成具有多样生物活性的化合物及本身具备相关性质的结构中至关重要，如甾体类似物氟氢可的松、眼科抗炎药物二氟泼酯、丙肝治疗药物索磷布韦、抗癫痫剂、抗抑郁药befloxatone，以及生物碱、碳水化合物衍生的氟代醇，并应用于液晶合成，在药物化学与材料化学领域应用广泛。现有非酶促化学方法虽可制备光学活性氟代醇，如外消旋或内消旋环氧化物开环、羰基衍生物的氟甲基化、α-氟酮的还原或氢化，但近年来生物转化凭借高选择性、温和与环境友好条件成为不对称合成有力工具，传统利用酵母和真菌氧化还原酶生物还原外消旋或前手性α-氟酮来不对称合成氟代醇。Pichia glucozyma酵母以往被发现可生物还原羰基两侧带大位阻取代基的底物（如1,2-（杂）二芳基乙烷-1,2-二酮、苯偶姻、酮酯、芳香酮），多在水相中进行，也能耐受疏水（DMSO 1% v/v、正庚烷或异辛烷50% v/v）或亲水（乙醇2.5% v/v）共溶剂以提高底物溶解度；但该酵母全细胞催化时产物光学纯度受胞内其他酮还原酶影响，且底物含额外官能团时会出现竞争反应（尤其是水解反应）。后续研究者从该酵母基因组鉴定出负责反应的蛋白KRED1-Pglu，属于NADP依赖的苯甲酰还原酶、短链醇脱氢酶(ADH)家族，在大肠杆菌克隆表达后用于一系列烷基芳基酮的生物还原，发现产物绝对构型随脂肪链长度变化发生立体偏好翻转（苯乙酮和苯丙酮得(R)构型醇，抗Prelog偏好；苯丁酮得相反对映体），分子建模解释了该立体化学反转；其后纯KRED1-Pglu被用于邻、间、对位单取代苯乙酮的生物还原，以及β-酮腈、α-氯、α-溴、α,α,α-三氟酮的还原，均得Prelog选择性和高光学纯度；该催化剂还能分批处理大位阻底物如ethyl secodione和前手性环状1,3-二酮，也用于固定化KRED1-Pglu与Bacillus megaterium葡萄糖脱氢酶(GDH)在环氧乙烷基-琼脂糖上混合床连续流装置。鉴于KRED1-Pglu对芳香酮立体选择性还原的高效性，以及氟代醇的重要性，研究人员在此探究了多种α-氟化（杂）芳香族和脂肪族酮的生物还原，优化影响酶催化的反应参数，以实现高转化率和选择性来制备有价值的手性卤代醇。
关键技术方法方面：研究人员首先化学合成一系列目标α-卤代酮并建立GC分析方法；采用大肠杆菌BL21 DE3 Star异源过表达KRED1-Pglu的冻干全细胞制剂，在磷酸缓冲液pH 8、30℃、加葡萄糖/GDH辅因子再生系统、NADPH、DMSO助溶条件下进行初始筛选还原α-氟酮；考察添加TBME共溶剂、底物浓度提升（5–30 mM）的影响；扩大底物范围至不同取代芳香α-氟酮、二氟酮、杂芳基酮、脂肪族α-氟酮；用空白对照（不表达KRED1-Pglu的大肠杆菌冻干细胞）评估内源酶干扰；将KRED1-Pglu纯化后在Tris-HCl缓冲体系中重复底物还原实验；选取代表性脂肪族α-氟酮（1-氟十二烷-2-酮）筛查包括RasADH、LbADH、SyADH、TeSADH、ADH-T、ADH-A、evo-1.1.200等其他ADH的还原性能；进行半制备规模（20 mg底物）放大验证；通过GC（手性与非手性柱）、乙酰化衍生测定转化率和ee；采用硅胶柱层析分离纯化产物并测定比旋光度。
结果部分：2.1 α-氟酮的生物还原：初始筛选。研究人员用冻干大肠杆菌/KRED1-Pglu在50 mM磷酸缓冲液pH 8、30℃、葡萄糖/GDH辅因子再生、NADPH、2% v/v DMSO条件下还原系列α-氟代苯乙酮（1a–f），所有底物均完全转化且ee >99%，得到(R)-氟代醇（因CIP规则下卤素优先级导致命名与Prelog实际(S)醇构型对应）。对于2,2-二氟苯乙酮（1g），需改用G6P/G6PDH辅因子再生系统以避免GDH单独还原底物；其也达>99%转化和ee。添加5% v/v TBME共溶剂（总有机溶剂2% DMSO+5% TBME）大多降低转化与ee，仅少数底物（如4-氯、4-甲氧基取代）转化全量但ee有降；二氟酮1g的ee降至12%。底物浓度提升至10 mM时多数底物仍维持>99%转化与ee（除4-甲氧基取代底物1e转化降至62%但ee >99%），再提至20–30 mM则转化与ee逐步下降，故选10 mM作后续范围。2.2 α-氟酮生物还原的底物范围。在10 mM底物、冻干细胞、2% DMSO条件下扩展底物：芳香α-氟酮带对位卤（4-F、4-Cl、4-Br、4-I）均得高转化，但对位Br与I的ee分别降至92%和70%；对位给电子基（4-OMe、4-Me）转化降至62%–67%，4-Me的ee降至92%，但间位OMe（3-OMe）与间位Cl仍维持>99%转化与ee；邻位Cl底物也>99%转化与ee；二氟苯乙酮（1g）>99%转化与ee；脂肪族1-氟十二烷-2-酮（1l）>99%转化与ee；杂芳基2,2-二氟-1-（噻吩-2-基）乙酮（1m）需用G6P/G6PDH系统，也高效还原。半制备规模（1d，20 mg，30 mM）用冻细胞得(R)-2d，ee 94%，柱纯化分离收率54%（氟代醇挥发性致损失）。2.3 用冻干大肠杆菌细胞的卤代酮生物还原。研究人员用不携带KRED1-Pglu质粒的大肠杆菌冻干细胞对照实验，发现胞内有内源酮还原酶具抗Prelog偏好（与KRED1-Pglu相反），且某些底物（如二氟酮1g、1m）可达>95%转化（内源酶还原），这可以解释较高底物浓度下ee下降源于内源ADH竞争。二氟酮需G6P/G6PDH避GDH干扰。2.4 用纯化KRED1-Pglu生物还原卤代酮。在Tris-HCl缓冲pH8、其余条件类似下，纯化KRED1-Pglu对所列α-卤（氟）代芳香酮（含邻、间、对位不同取代）、二氟酮、杂芳基二氟酮（1m，得(S)-醇因为硫CIP优先级高于氟改变命名）、脂肪族1l（转化95%，ee>99%）、α,α-二氟-β-酮酯底物均实现>99%转化（除1l为95%）与>99% ee（按CIP命名多为(R)，1m为(S)），证实冻细胞所得选择性主要来自KRED1-Pglu而非内源酶。2.5 用其他ADH对1-氟十二烷-2-酮（1l）的筛查。研究人员测试了实验室其他重组ADH（RasADH、LbADH、SyADH、TeSADH、ADH-T、ADH-A、商业evo-1.1.200）对该脂肪族α-氟酮的还原：ADH-A与KRED1-Pglu（冻细胞及纯化）均>99%转化、>99% ee (R)；evo-1.1.200得93%转化、>99% ee (S)；ADH-T得91%转化、>99% ee (R)；TeSADH得82%转化、90% ee (R)；LbADH得98%转化、88% ee (S)；SyADH得97%转化、10% ee (R)；RasADH仅21%转化。表明KRED1-Pglu与ADH-A为Prelog偏好高效，evo-1.1.200为抗Prelog高效，可实现两对映体的高对映纯制备。
讨论与结论总结：研究人员通过对KRED1-Pglu（源自Pichia glucozyma的酮还原酶，在大肠杆菌异源过表达）生物还原系列α-卤代酮的研究，系统优化了有机溶剂种类与比例（2% v/v DMSO适宜，添加TBME多有害）、底物浓度（10 mM为冻细胞体系最适，更高会降转化与ee）等参数；使用纯化酶消除了大肠杆菌内源ADH的竞争与干扰，确认了KRED1-Pglu本身的Prelog型立体选择性（按CIP规则命名为(R)-氟代醇，对应实际醇中心Prelog的(S)当氟优先级高时需注意命名转换），纯化酶对多种α-单氟、α,α-二氟酮（芳香各族取代、杂芳基噻吩、脂肪长链）均给出>99%转化与>99% ee（例外：脂肪族1l转化95%但ee>99%；杂芳基二氟酮按CIP得(S)因硫优先级）；冻干全细胞虽总体高效但高浓度时内源酶竞争会降低ee；其他ADH筛查显示KRED1-Pglu与ADH-A为Prelog高效，evo-1.1.200为抗Prelog高效，可互补制备两对映体氟代醇；半制备规模验证了实用性（20 mg底物得94% ee，分离收率54%受挥发性影响）。该研究表明KRED1-Pglu是制备广谱(R)-氟代醇（产率62%→99%，ee 70%→99%）的优异生物催化剂，对（杂）芳香、脂肪族、单/二卤代α-酮均适用，纯酶体系化学选择性更优，具有重要合成应用价值。
