人工金属裂合酶的结构导向型表面工程化设计及其高对映选择性迈克尔加成催化

《ChemCatChem》：Structure-Guided Surface Engineering of an Artificial Metallolyase for Highly Enantioselective Michael Addition

　　

研究人员基于TM1459 cupin折叠的非血红素铜蛋白（nonheme copper protein）进行了工程化改造，使其能够催化2-硝基丙烷对2-氮杂查尔酮的立体选择性迈克尔加成（Michael addition）。通过金属中心筛选与第二配位圈（secondary coordination sphere）工程化改造，实现了对初始对映选择性的调控。进一步的X射线晶体学（X-ray crystallography）分析鉴定出蛋白质表面存在非特异性金属结合位点，而针对性表面残基突变有效抑制了不期望的背景反应。该结构导向策略显著提升了催化性能，使反应最高可分别达到98%对映体过量（ee）（S）和99% ee（R）。这些结果表明，基于可视化信息驱动的突变位点选择，为人工金属酶（artificial metalloenzymes）的优化提供了一种强有力且具有普适性的策略。

该论文发表于《ChemCatChem》，围绕人工金属酶（artificial metalloenzyme）的精准优化展开，研究重点是如何借助结构生物学信息提升非天然催化反应中的对映选择性。迈克尔加成（Michael addition）是有机合成中极具价值的碳—碳键构建反应，尤其是硝基烷烃对烯酮的加成，在药物活性分子和手性合成砌块制备中具有重要意义。其中，2-氮杂查尔酮与硝基化合物形成的加成产物可进一步转化为尼古丁衍生物，而后者与烟碱型乙酰胆碱受体相关，在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的预防和缓解研究中具有潜在应用价值。既往以仲胺催化剂实现2-硝基丙烷对2-氮杂查尔酮的不对称迈克尔加成，虽然可获得较高的S-对映选择性，但普遍存在反应时间长、催化剂用量高、绿色化与实用性不足等问题。因此，开发更高效、更绿色且具有高立体选择性的催化体系，成为该领域的重要挑战。

在这一背景下，研究人员聚焦于基于TM1459 cupin蛋白骨架构建的非血红素铜人工金属酶。TM1459来源于Thermotoga maritima，具有由4个组氨酸（His）构成的金属结合位点，可形成特定的金属配位几何结构。研究团队此前已通过His→Ala定点突变建立起小型突变体文库，获得3-His面式三联体、经式三联体以及2-His二联体等不同配位模式，并证实该平台适用于环丙烷化和线性硝基烷烃参与的迈克尔加成反应。本研究进一步将该体系拓展到位阻更大的支链硝基烷烃2-硝基丙烷，以解决催化活性与立体控制更难兼顾的问题。全文的核心思想并非单纯通过活性位点突变提升选择性，而是将金属中心筛选、第二配位圈改造和蛋白表面工程化结合起来，特别是利用X射线晶体学直接观察非特异性铜结合位点，从而有针对性地消除背景催化来源，最终显著提高对映选择性。

就关键技术方法而言，研究主要采用了以下几类策略：其一，构建并筛选TM1459突变体小型文库，通过第一配位圈（primary coordination sphere）His→Ala或His→Gly替换改变铜配位几何与底物结合环境；其二，利用X射线晶体学解析铜浸泡晶体结构，并结合苦烟酸类似物吡啶甲酸（picolinic acid）共浸泡，直接可视化蛋白表面非特异性铜结合位点；其三，实施第二配位圈和表面残基的定点突变，评估其对产率与对映选择性的影响；其四，使用手性色谱高效液相色谱（chiral HPLC）测定反应产率与对映体过量。样本来源并非临床队列，而是人工构建与纯化的TM1459蛋白突变体及其铜配合体系。

在结果部分，论文首先保留并展开了不同层面的工程化路线。第一部分可概括为对第一配位圈突变体文库的筛选。研究人员首先评估既有TM1459小型文库在2-硝基丙烷与2-氮杂查尔酮反应中的表现。结果显示，不同铜配位几何结构导致显著不同的对映选择性：H52A倾向生成S-对映体，达到62% ee；H54A/H58A双突变体则优先生成R-对映体，达到87% ee。这说明仅通过第一配位圈调控，已可实现对两种对映体生成方向的切换，但整体立体选择性仍然有限。

第二部分围绕非特异性表面铜结合位点的发现及其影响。研究人员提出，选择性受限的一个重要原因可能是蛋白表面存在非特异性铜结合，导致活性中心之外的背景催化。对铜浸泡后的H52A晶体进行1.035 ?高分辨率结构解析后，除了催化相关的Cu1和Cu2，还观察到位于蛋白表面、远离活性位点的第3个Cu²⁺位点Cu3。该位点由Glu90侧链与N端Gly参与配位。结合“游离Cu²⁺也可催化迈克尔加成”的实验结果，研究人员据此判断，表面Cu3很可能参与非对映选择性的背景反应，从而拉低总体ee值。这一发现构成了后续结构导向表面工程化的直接依据。

第三部分是N端截短策略对非特异性铜结合的抑制。由于直接突变Glu90会导致蛋白在纯化过程中严重聚集，研究人员改用SUMO融合表达策略制备N端截短突变体。该方法不仅改善了TM1459折叠效率，还成功获得此前较难制备的若干2-His和3-His变体。更重要的是，晶体学结果证实N端截短后的tH52A不再具有Cu3位点。功能上，tH52A的对映选择性提高至74% ee（S），较原H52A提高12%；tH54A/H58A的R选择性也由87% ee提高至93% ee。与此同时，改变蛋白与CuSO₄摩尔比或对样品脱盐并未明显影响反应结果，说明提升并非来自游离铜减少，而更可能来自非特异性结合位点的清除。这一部分明确建立了“抑制表面非特异性铜结合可提高立体选择性”的因果联系。

第四部分是围绕S选择性体系的进一步优化。由于tH52A和tH52A/H92A都偏向生成S-对映体，研究人员推测52位和92位残基对立体控制尤为关键，因而以Gly替代His以扩大构象变化。结果表明，tH52G/H92A在保持74% ee（S）的同时，产率由38%提高至81%，表现出更优的催化效率。这说明通过微调第一配位圈及邻近空间构象，可在不牺牲对映选择性的前提下增强反应活性。

第五部分是第二配位圈工程化。鉴于邻近活性位点的芳香族大体积残基有助于立体诱导，研究人员在高选择性变体中引入F104W突变。结果显示，tH52G/H92A/F104W达到92% ee（S），tH54A/H58A/F104W达到97% ee（R）。该结果证明，第二配位圈工程化能够进一步强化底物取向控制，是提高ee值的重要补充手段。

第六部分是基于底物类似物共浸泡的进一步可视化与表面工程化。尽管N端截短已经改善了选择性，但研究人员怀疑仍有其他非特异性金属位点未被发现。为更清楚地揭示潜在“杂散”反应位点，他们将H52A晶体与CuSO₄及底物类似物吡啶甲酸共同浸泡，最终观察到额外3个表面铜位点Cu4、Cu5和Cu6。Cu4由Tyr7、Glu101、Glu103及吡啶甲酸共同支持形成近似方锥几何；Cu5由Asp50参与配位；Cu6则与Glu44和Glu101相关。这一结果说明，表面暴露的Asp、Glu和Tyr残基能够形成偶发性铜结合位点，并可能为背景反应提供催化微环境。

第七部分是针对这些表面位点的定向突变验证。研究人员将相应残基分别替换为不易配位的氨基酸，并与tH52A组合。结果显示，tY7F/H52A与tE44Q/H52A均提高了S选择性，分别达到79% ee和87% ee；而tD50N/H52A则降低了催化活性。这表明，并非所有表面铜位点对背景催化贡献相同，其中E44相关位点的抑制效果尤为明显。相比之下，对于未经过结构指导而系统随机选择的其他表面Asp/Glu残基突变，只有少数变体表现出一定改进，成功率明显低于晶体学直接识别位点。这一对比有力证明了“可视化引导的突变位点筛选”优于无指导突变。

第八部分是将表面突变与高选择性骨架组合后的最终优化。研究人员把E44Q和D50N分别并入含F104W的高选择性变体中。tE44Q/H52G/H92A/F104W达到95% ee（S），产率70%；tE44Q/H54A/H58A/F104W达到99% ee（R），产率71%。值得注意的是，D50N虽然在简单背景下不利，但在F104W组合中却表现出积极效应，可实现98% ee（S）和99% ee（R）。此外，D50N/H52G/H92A/F104W的晶体学分析显示Cu5位点消失，为“抑制表面偶发铜结合可提升立体选择性”提供了直接结构证据。

讨论部分的核心在于方法学价值而非单一反应性能。研究表明，以往抑制非特异性金属结合往往依赖对大量His残基进行广泛突变或化学修饰，但在人工金属酶中，金属离子还可能与Asp、Glu、Cys、Met和Tyr等多类侧链发生配位，因此若采用穷举式优化将非常复杂低效。虽然近年来计算设计已能在一定程度上帮助构建非血红素金属中心，但对非特异性金属结合的精准抑制仍属难点。本研究的优势在于，借助X射线晶体学直接识别导致背景催化的表面金属位点，再进行精准突变，从而避免盲目筛选。尤其是观察到可与吡啶甲酸配位的铜位点，提示人工金属酶表面“酶促多能性”或“底物兼容性相关偶发结合”是影响选择性的重要因素，这对于未来人工金属酶设计具有普遍启示意义。

结论部分可译述如下：研究人员开发了一种能够高对映选择性催化2-硝基丙烷与2-氮杂查尔酮发生立体选择性迈克尔加成的人工金属酶。通过整合金属中心筛选、TM1459 cupin骨架的第二配位圈工程化，以及基于X射线晶体学可视化非特异性金属结合位点的表面残基重设计，显著提升了催化性能，使S-对映体最高达到98% ee，R-对映体最高达到99% ee。该研究表明，利用晶体学分析直接选择突变位点，是精细调控人工金属酶性能的一种高效且具有广泛适用性的策略，并将有助于推动下一代高选择性、可调反应性的金属酶体系开发。