含硫醇基深共熔溶剂（DES）作为氧化还原酶二合一辅因子再生介质：理解非惰性溶剂

《ChemCatChem》：Thiol-Containing Deep Eutectic Solvents as 2-In-1 Cofactor Regeneration Media For Oxidoreductases: Understanding Non-Innocent Solvents

　　

氧化还原酶表现出较高的对映选择性和化学选择性，但其工业应用常受限于辅因子依赖性和底物在水相中溶解度差的问题。深共熔溶剂（DES）可通过充当酶兼容介质、底物增溶剂和辅因子再生系统来解决这些问题。本研究提出一类新型含硫醇基DES用于生物催化，其功能为二合一溶剂和辅因子再生器。来自Thermus thermophilus的嗜热硫氧还蛋白还原酶/硫氧还蛋白-1（TR/Trx-1）利用二硫苏糖醇（DTT）再生NADPH。由氯化胆碱（ChCl）、甜菜碱（Bet）或甘油（Gly）制备的DTT基DES能够在维持酶兼容性的同时实现更高DTT浓度。然而，有效的DES设计需平衡多个参数，尤其是水含量和最终pH，它们强烈影响酶的稳定性和活性。在DES–水介质中，预先调节缓冲液pH对于获得最优条件至关重要。在以Lactobacillus brevis醇脱氢酶（LbADH）结合TR/Trx-1将苯乙酮还原为(R)-苯乙醇的反应中，在DTT基DES里进行了评估。优化条件（20 vol.% DES，最终pH 7.5）实现了更高底物投料量（75 mM）和产率（82%），不过酶稳定性仍然有限。将介质工程与蛋白质工程相结合，对于充分利用这些可调溶剂体系至关重要。

该研究发表于《ChemCatChem》。研究背景方面，传统水相生物催化面临底物水溶性差、辅因子成本高及氧化还原酶辅因子依赖性限制工业应用等问题；非传统介质如有机溶剂、超临界流体和新型溶剂被广泛探索，其中深共熔溶剂（DES）因低挥发、低毒、可调性强且可作为“设计溶剂”受到关注，DES已由氢键受体（HBA，如季铵盐）与氢键供体（HBD，如尿素、多元醇、有机酸）构成多类体系，但高黏度常需加水或缓冲液调控，同时DES组分可兼具底物或辅底物实现“二合一（2-in-1）”策略；已有研究利用葡萄糖、1,4-丁二醇等作为HBD兼辅底物实现辅因子再生，但硫醇类化合物作为HBD兼辅因子再生供体的DES尚未系统研究；Zhang等报道Thermus thermophilus硫氧还蛋白还原酶/硫氧还蛋白-1（TR/Trx-1）可用多种硫醇辅底物再生NADPH，其中二硫苏糖醇（DTT）催化效率最高（93 mM^?1·min^?1），氧化形成稳定六元环产物推动平衡向还原方向，且系统耐热耐溶剂，但与Lactobacillus brevis醇脱氢酶（LbADH）联用还原苯乙酮至(R)-苯乙醇时需很高DTT投料（达主底物15倍），总产率受限（24 h达67%），因此研究人员设想将DTT同时作为DES的HBD和辅因子再生辅底物，构建二合一DES介质以提升局部DTT浓度、增溶底物并稳定酶，从而克服原有局限。为此研究人员设计并表征了DTT基DES体系，筛选合适HBA（氯化胆碱ChCl、甜菜碱Bet）与可选第三组分甘油（Gly）作为HBD共组分，系统考察物理化学性质、pH行为、水活度、酶热稳定性及TR/Trx-1_LbADH级联还原苯乙酮的性能，优化水含量、缓冲液初始pH、DES体积比、酶与辅因子添加策略，最终实现更高底物负载与产率。

主要关键技术方法包括：制备二元DES如ChCl-DTT（1:3）、Bet-DTT（1:3）与三元DES如ChCl-Gly-DTT（1:3:3）、Bet-Gly-DTT（1:3:3），测定密度、黏度、热重（TGA） onset分解温度、水活度（a_w）；采用纳米差示扫描荧光（NanoDSF）测定纯化酶LbADH在不同DES-缓冲液体积比下的熔解温度（T_m）以评估热稳定性；构建TR/Trx-1与LbADH级联催化苯乙酮还原为(R)-苯乙醇的反应体系，在DES-Tris缓冲液混合介质中考察DES体积比（20、50 vol.%等）、缓冲液初始pH（7.5、8.0、9.0等）对应的终pH、DTT（兼DES组分）有效浓度、底物投料（35 mM、75 mM）、随时间（24–96 h）产物产率变化；通过对照实验（单酶LbADH对照、加酶/辅因子追加实验）区分背景DTT氧化与辅因子再生贡献；采用双向方差分析（two-way ANOVA）统计评估TR/Trx-1与NADP⁺追加对产率的影响显著性。

2.1 专为二硫苏糖醇基深共熔溶剂的定制设计：研究人员制备了ChCl-DTT（1:3）、Bet-DTT（1:3）、ChCl-Gly-DTT（1:3:3）、Bet-Gly-DTT（1:3:3），测定密度相近（约1.27–1.29 g·mL^?1），Bet基DES黏度显著高于ChCl基（Bet-DTT达1446.7 mPa·s，ChCl-DTT为466.9 mPa·s），三元加甘油可降低黏度（Bet-Gly-DTT为1143.7 mPa·s，ChCl-Gly-DTT为508.8 mPa·s）；水含量6–8 wt.%，TGA显示DES中水无～100°C明显失重台阶（纯甜菜碱有），说明水强结合于氢键网络，水活度（a_w）低（0.044–0.076）且偏离理想负偏差，证实亲水性DES中水紧密整合；pH测定表明纯DES均酸性（ChCl基强于Bet基），DES-纯水混合时ChCl-DTT随水增加pH略降（20 vol.%为3.2，50 vol.%为2.7），Bet-DTT则随水增加pH略升（纯DES约4.5，50 vol.%水达5.1），加甘油不改变pH趋势；DES与100 mM Tris（起始pH 7.5）混合时缓冲能力减缓酸化但终pH仍降（20 vol.%终pH 6.6，50 vol.%终pH 6.3），因起始pH近缓冲下限；为达TR/Trx-1所需pH≥7.5，研究人员将Tris起始pH调至8.0，得20与50 vol.% DES终pH均约7.6，证明预调缓冲液pH是实现DES-水介质酶兼容的关键。

2.2 硫醇基DES-缓冲液混合体系中酶的耐热稳定性：通过NanoDSF测纯化酶LbADH的T_m，TR与Trx-1无明确熔解峰且易聚沉无法测T_m；LbADH的T_m随DES体积比升高而增加（纯Tris pH7.5为45.9°C），Bet与Gly体系增幅更大，80 vol.% Bet-Gly-DTT（1:3:3）达61.6°C（升约15.7°C），ChCl-DTT（1:3）在20与50 vol.%反而略降T_m（43.8、43.5°C）但80 vol.%回升至49.6°C；单组分20 wt.%对照表明Gly、Bet、DTT均能提升T_m（Gly最高），ChCl中等；表明Bet-Gly-DTT三元具协同稳定LbADH效果，与LbADH（短链脱氢酶还原酶SDR，需结构Mg²⁺）结构相关，不同于依赖Zn²⁺的中链脱氢酶（如HLADH）对低水活度更敏感；综上Bet/Gly/DTT三元DES最利于LbADH热稳定。

2.3 辅因子再生级联：先在标准缓冲（100 mM Tris pH7.5，125 mM DTT，35 mM苯乙酮，30°C）确认TR/Trx-1_LbADH级联24 h产率约73%，单酶LbADH对照因背景DTT氧化致少量(R)-苯乙醇（24 h约5%）；选Bet-DTT（1:3）为模型DES（组成变化如加甘油在稀释下未明显影响转化率），考察DES体积比与缓冲起始pH：20 vol.% DES时Tris起始pH7.5（终pH6.6）产率23.4%，起始pH8.0（终pH7.6）升至63.9%，起始pH9.0（终pH8.5）降至27.2%；50 vol.% DES对应产率为9.1%（终pH6.6）、22.8%（终pH7.6）、10.2%（终pH8.5）；说明终pH7.5左右兼顾TR/Trx-1（需≥7.5）与LbADH（酸性利于催化酪氨酸质子化促进加氢），过碱抑制LbADH；50 vol.% DES无论有无TR/Trx-1产率相近（～23% vs 19%），表明高DES比例损害TR/Trx-1介导辅因子再生，偏向LbADH背景DTT氧化；时间曲线：20 vol.% Bet-DTT（终pH7.6）48 h产率82%，追加LbADH无提升（限速为TR/Trx-1稳定性或反应平衡），50 vol.%体系48 h仅32%、96 h 41%，追加LbADH也无提升；在20 vol.%体系追加TR/Trx-1（24 h后）使产率从59%（24 h）升至87%（48 h），追加NADP⁺（48 h后）进一步至93%（72 h平顶），表明TR/Trx-1不稳定为关键限制；放大底物至75 mM（纯缓冲溶解度52.9 mM，20 vol.% DES介质达79.4 mM），同样终pH7.6、20 vol.% Bet-DTT，设追加策略：仅加TR/Trx-1（24 h后）、仅加NADP⁺、两者都加、无追加；结果24–96 h产率增幅显著只见于加TR/Trx-1（24 h36%→96 h82%）与两者都加（类似82%），仅加NADP⁺（70.3%）与无追加（67.5%）相近；two-way ANOVA证实TR/Trx-1追加影响极显著（p=1×10^?5），NADP(H)稳定性无显著影响；说明TR/Trx-1稳定性是级联主要瓶颈。

讨论部分总结：DES可通过调控制备兼具底物增溶、酶兼容与辅因子再生二合一功能的非传统介质，但DES设计非简单，需综合考虑水含量、终pH（预调缓冲至关重要）、DES比例对酶活与溶解度的平衡；本研究首次构建DTT基DES作为硫醇平台用于TR/Trx-1介导NADPH再生，克服以往高DTT投料仍低周转的限制，DTT同时作DES的HBD组分与辅底物，提升局部浓度并增溶苯乙酮（20 vol.% DES下从52.9 mM至79.4 mM）；优化终pH7.6、20 vol.% Bet-DTT体系实现35 mM底物63.9%产率、75 mM底物下82%产率（较纯缓冲提升明显）；统计证明显著限制为TR/Trx-1稳定性而非NADP(H)；未来需通过蛋白质工程或固定化稳定TR/Trx-1，开发廉价天然还原剂、氧化DTT回收策略（如刺激响应疏水DES相分离），并结合介质工程与酶改造以推进工业应用；结论部分译文：DES可调控设计兼具底物增溶能力与酶兼容性且高效辅因子再生系统的反应介质；但DES实施并不简单，因为溶剂介质与底物及酶相互作用从而影响整体催化表现。本工作阐明了DES生物催化设计中常被忽视的挑战，即DES-水介质终pH的影响以及如何用预调pH缓冲液维持更优反应条件；此外研究人员引入了新型硫醇基DES平台用于TR/Trx-1酶辅因子再生；此前TR/Trx-1作为辅因子再生系统受低转化数（24 h 67%）与高辅底物（DTT）需求限制，而DTT基DES可作为二合一反应介质的共溶剂；总体策略旨在通过优化条件稳定生物催化剂（利于长期实验或连续系统）同时提高辅因子再生系统辅底物投料；本研究也凸显DES生物催化（及其他合成方法）设计相关挑战：DES并非惰性溶剂，其与底物、产物、酶、辅因子的相互作用构成复杂图景，须在理性应用前深入理解；此处研究人员观察到pH对维持适当酶活性的重要性，DES比例对保持高溶解能力与酶稳健性同样关键；调优pH与水含量后DES配方反应产率达82%；底物从35提至75 mM并结合酶与辅因子稳定性研究使反应产率翻倍，归因于辅底物高可得性与酶稳定性提升；双向ANOVA证实反应进程与TR/Trx-1稳定性显著相关；因此为进一步改进系统并面向新建DES的工业应用，应通过蛋白质工程或固定化稳定辅因子再生系统，且须强化过程至更高产物浓度；此外研究易得、低成本或天然还原剂及氧化DTT再循环策略值得开展，例如设计疏水性刺激响应DTT基DES，可对pH或温度等输入响应相分离，回收DES相并再利用DTT组分于生物催化或高分子化学；总之所述策略突出了可为反应需求定制设计与调控新型DES且同时保持酶兼容性的工作流程可能性。