材料引导的基因-可电离脂质纳米颗粒逆转肾癌中铁相关免疫抵抗

《Advanced Science》：Materials-Guided Gene-Ionizable Lipid Nanoparticles to Reverse Iron-Associated Immune Resistance in Renal Cancer

　　

铁过载是肿瘤中常见的代谢紊乱，并与肾细胞癌（RCC）的不良预后相关，但其对肿瘤免疫微环境的影响仍不清楚。在此，研究人员鉴定出一条此前未被认识的免疫抑制轴：铁过载下调CD8⁺ T细胞中的棕榈酰转移酶ZDHHC12，导致线粒体蛋白FDX1的棕榈酰化受损。这稳定了FDX1并驱动铜死亡（cuproptosis），一种近期被描述的铜依赖性细胞死亡通路，从而损害T细胞效应功能并减弱对免疫检查点阻断的反应。为恢复T细胞活性，研究人员工程化设计了用于递送Zdhhc12的脂质纳米颗粒（ZDHHC12-LNP）。这些纳米颗粒表现出最佳的理化性质，有效恢复FDX1棕榈酰化，挽救CD8⁺ T细胞功能，并在临床前RCC模型中与PD-1阻断协同作用且不诱导全身毒性。研究人员的发现揭示了铁-ZDHHC12-FDX1轴作为T细胞免疫代谢检查点，并展示了一种基于纳米技术的策略来克服铁驱动的免疫抑制，为铁过载RCC患者提供了转化潜力。

肾细胞癌（RCC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展与机体代谢状态密切相关。铁作为人体必需微量元素，其代谢紊乱与肿瘤进展密切相关。流行病学研究表明，RCC患者血清铁水平显著升高，且高铁负荷与疾病分期和不良预后相关。约四分之三的RCC患者存在VHL基因突变，导致缺氧诱导因子（HIFs)持续激活，进而上调转铁蛋白受体1（TFR1)和二价金属转运体1（DMT1)等铁摄取基因的表达，同时抑制肝脏铁调素分泌，最终造成系统性及局部肿瘤铁过载。尽管铁过载在RCC细胞中的作用已被阐明，但其在肿瘤免疫微环境(TME)中对其他细胞的影响尚不清楚。

目前，PD-1抑制剂已成为晚期RCC一线治疗的重要手段，但部分患者对其反应性较差。CD8⁺ T细胞是抗肿瘤免疫的核心效应细胞，其细胞毒功能是大多数有效癌症免疫治疗的关键机制。系统性了吧没恢复到全接下来，研究人员此次研究了铁过载对CD8⁺ T细胞功能的影响及其分子机制，并探索基于纳米技术的干预策略。

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研究人员首先发现，长期高铁饮食显著促进小鼠RCC进展。通过蛋白质组学分析，研究人员在高铁相关的RCC组织中鉴定出棕榈酰转移酶ZDHHC12的表达显著下调。值得注意的是，ZDHHC12的敲除或过表达并不影响RCC细胞自身的增殖，但在Zdhhc12敲除小鼠中，高铁饮食的促肿瘤作用显著增强，表明ZDHHC12在铁过载诱导的RCC进展中发挥关键作用。

进一步研究表明，ZDHHC12主要在增殖期CD8⁺ T细胞中高表达。在铁过载条件下，CD8⁺ T细胞中ZDHHC12蛋白水平显著降低，而其mRNA水平不变。研究人员通过CD8⁺ T细胞耗竭实验证实，CD8⁺ T细胞是铁过载发挥免疫抑制效应所不可或缺的。Zdhhc12敲除显著促进RCC体积增长和重量增加，并损害肿瘤中CD8⁺ T细胞的浸润，降低颗粒酶B（GZMB)和干扰素-γ（IFN-γ)阳性细胞比例。

为阐明铁过载下调ZDHHC12的分子机制，研究人员发现外源性铁补充以浓度依赖性方式降低ZDHHC12蛋白水平，且该降解过程可被翻译抑制剂CHX追踪。蛋白质谱分析揭示TRIM28可能结合ZDHHC28，且TRIM28作为E3泛素连接酶可降低蛋白稳定性。研究证实，TRIM28敲除显著减缓ZDHHC12降解；TRIM28的RING结构域对其E3连接酶活性至关重要，该结构域缺失的TRIM28突变体无法降解ZDHHC12。外源性铁补充增强ZDHHC12-TRIM28结合及ZDHHC12-泛素结合，TRIM28通过介导K48连接的多泛素化促进蛋白质酶体依赖性的ZDHHC12降解。

在明确ZDHHC12下游机制方面，研究人员通过质谱分析发现ZDHHC12可能与FDX1相互作用。FDX1是铜死亡（cuproptosis)通路中的关键基因，铜死亡是一种新近发现的铜依赖性细胞死亡方式。研究通过免疫共沉淀、免疫荧光共定位、GST pulldown和分子对接实验证实ZDHHC12与FDX1的直接结合。ZDHHC12敲低上调FDX1蛋白水平而其过表达则下调FDX1，但二者均不影响FDX1 mRNA水平。FDX1定位于线粒体基质，研究人员发现ZDHHC12通过影响线粒体基质蛋白酶AFG3L2介导的非经典蛋白降解途径调控FDX1稳定性。Zdhhc12敲除小鼠肾癌CD8⁺ T细胞中DLAT和DLST的脂酰化水平显著升高，而铜死亡诱导剂对细胞的杀伤作用增强，DLAT寡聚化增加。铜死亡抑制剂TTM可逆转Zdhhc12敲除引起的铜死亡增加，敲低FDX1同样可逆转这一现象。透射电子显微镜观察显示，Elesclomol-Cu处理诱导线粒体皱缩和嵴消失，ZDHHC12敲低加剧了这一损伤，而同时敲低FDX1则可逆转该损伤。

更为重要的是，研究人员证实ZDHHC12介导FDX1在Cys152/155位点的棕榈酰化修饰。通过酰基-生物素交换（ABE)实验和Click-iT棕榈酸叠氮化物标记，研究人员确认FDX1可被棕榈酰化，且该修饰被2-BP抑制。质谱分析鉴定C152和C155为FDX1棕榈酰化位点，且具有进化保守性。与野生型FDX1相比，C152S或C155S单突变体棕榈酰化水平降低，而C152S/C155S双突变体几乎检测不到棕榈酰化。ZDHHC12催化结构域DHHC中的C127残基对其酶活性至关重要，ZDHHC12 C127S突变体无法恢复CD8⁺ T细胞中GZMB和IFN-γ的比例。FDX1野生型过表达降低CD8⁺ T细胞中GZMB和IFN-γ比例，而FDX1 C152S/C155S双突变体则无此效应。

基于上述机制发现，研究人员开发了搭载Zdhhc12 mRNA的脂质纳米颗粒（ZDHHC12-LNP)用于治疗干预。该纳米颗粒采用已建立的离子化脂质SM-102，配合DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000，通过微流控技术封装Zdhhc12 mRNA。表征结果显示，ZDHHC12-LNP平均粒径为64.8 nm，zeta电位为-2.6 mV，分散性优异（PDI = 0.03)，封装效率高达97.7%。冷冻电镜证实其典型球形结构，质谱分析和色谱检测进一步验证样本高纯度和mRNA加帽效率。功能实验表明，ZDHHC12-LNP有效转染CD8⁺ T细胞，显著增加Flag-Zdhhc12表达水平，并诱导Fdx1蛋白棕榈酰化的明显改变。瘤内注射后，ZDHHC12-LNP显著提高CD8⁺ T细胞和肿瘤细胞中ZDHHC12表达。安全性评估显示，ZDHHC12-LNP治疗后血清ALT、AST、CRE和BUN水平与对照组无显著差异，表明该纳米颗粒系统实现高效基因递送且不损害肝肾功能。体内分布研究显示，荧光标记的LNP主要滞留于肿瘤组织和淋巴结，肝脏和脾脏仅检测到极弱信号，证实瘤内注射后极少发生脱靶分布。

临床相关性分析中，研究人员对接受辅助PD-1抑制剂治疗后2年内出现疾病进展的RCC患者标本进行免疫组织化学染色，发现这些患者普遍存在铁过载和较低的ZDHHC12表达水平。联合治疗实验表明，铁过载减弱PD-1抑制剂的抗肿瘤效果，而ZDHHC12-LNP给药可消除铁过载的额外促肿瘤效应，并增强PD-1阻断的治疗效果。治疗各组间体重及肝肾功能无显著差异。

在讨论部分，研究人员总结了本研究的主要发现：首次揭示铁过载通过下调ZDHHC12、减少FDX1棕榈酰化，进而激活CD8⁺ T细胞铜死亡的免疫抑制新机制；开发出基于LNP的ZDHHC12 mRNA递送系统，有效恢复铁过载条件下CD8⁺ T细胞功能，为克服铁驱动的免疫抑制提供了有前景的治疗策略。研究同时指出若干局限性：铁过载的影响可能超出CD8⁺ T细胞范围，其他先天免疫细胞在铁过载条件下的作用有待探究；ZDHHC12的其他潜在下游效应子尚需进一步探索；开发CD8⁺ T细胞靶向LNP可能进一步增强抗肿瘤免疫疗效；持续局部给药对肿瘤复发的影响值得研究。

研究结论：研究人员首次揭示了一条新的免疫抑制轴，即铁过载下调ZDHHC12，减少FDX1棕榈酰化，从而激活CD8⁺ T细胞铜死亡，最终损害抗肿瘤免疫。研究人员将ZDHHC12鉴定为一个有前景的治疗候选靶点。重要的是，研究人员开发的脂质纳米颗粒（LNP)封装ZDHHC12靶向化合物有效恢复了高铁条件下CD8⁺ T细胞功能，提供了一种有前景的治疗策略来对抗铁诱导的免疫抑制并增强癌症免疫治疗效果。