肿瘤微环境/近红外双响应锌基靶向纳米激动剂用于STING介导癌症免疫治疗的多模态放大

《Advanced Science》：TME/NIR Dual-Responsive Zinc-Based Targeted Nanoagonist for Multimodal Amplification of STING-Mediated Cancer Immunotherapy

　　

环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）通路的精准激活是实现有效肿瘤免疫治疗的重要挑战，其原因在于免疫应答的复杂性以及肿瘤微环境（TME）的限制。该研究开发了一种多功能纳米激动剂cRGD-PDA/ZIF8@ICG/TPT（cDZ@IP），以实现纳米代谢物驱动的STING通路多模态协同激活并增强免疫识别。该激动剂将cRGD肽靶向的聚多巴胺（PDA）包覆的沸石咪唑酯骨架-8（ZIF-8）与光敏剂吲哚菁绿（ICG）以及化疗药物拓扑替康（TPT）相结合。在近红外（NIR）激光照射下，cDZ@IP在TME中降解，产生高水平的活性氧（ROS），诱导线粒体应激并释放内源性线粒体DNA（mtDNA）。此外，拓扑替康通过抑制核DNA修复增强DNA损伤的积累。从激动剂中释放的Zn²⁺进一步放大了cGAS-STING通路的激活，从而确保产生强效的免疫应答。温和光热治疗（mPTT）诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）促进抗肿瘤免疫的启动，同时增强免疫检查点阻断的有效性。体内研究显示，cDZ@IP显著抑制原发灶和远端肿瘤生长并阻止肺转移，为STING通路靶向的癌症免疫治疗提供了有前景的策略。

该研究聚焦于结直肠癌（CRC）中cGAS-STING通路的激活难题，旨在开发一种能够精准、可控地激活STING通路的新型纳米免疫治疗策略。研究背景源于传统STING激动剂存在的稳定性差、靶向性不足及全身毒性等问题，同时化疗或光动力治疗虽可诱导胞质DNA释放以激活STING通路，但面临免疫激活不充分、持续时间短以及免疫抑制性TME等挑战。此外，Zn²⁺增强cGAS-STING信号的研究提示金属离子辅助策略具有潜力，而化疗诱导的ICD不足问题也可通过mPTT协同改善。

研究人员构建了基于金属有机框架（MOF）的多功能纳米激动剂cDZ@IP，其核心为共载TPT和ICG的ZIF-8（即Z@IP），表面依次修饰PDA和cRGDfk-PEG2k-NH2以增强肿瘤靶向性。该纳米系统利用细胞内H⁺/谷胱甘肽（GSH）和NIR激光作为内源性和外源性触发因素，在肿瘤部位实现纳米激动剂的精准解组装。ICG在NIR光照下产生ROS造成线粒体氧化损伤并释放mtDNA，TPT通过抑制核DNA修复促进胞质DNA积累，而Zn²⁺的过载进一步增强cGAS酶活性，三者协同放大cGAS-STING通路激活，同时mPTT诱导ICD，共同促进树突状细胞（DC）成熟和CD8⁺ T细胞浸润，并与免疫检查点阻断产生协同效应。

研究关键技术方法包括：采用溶剂热法制备ZIF-8基纳米颗粒并通过PDA介导的表面修饰策略进行功能化；利用透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）、动态光散射（DLS）及电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等进行材料表征；通过CLSM和流式细胞术评估细胞摄取；采用DCFH-DA探针和单线态氧传感器绿（SOSG）检测ROS；以JC-1探针和Bio-TEM评估线粒体损伤；通过γ-H2AX免疫荧光和PicoGreen dsDNA检测DNA损伤；运用Western blot、ELISA、免疫荧光及流式细胞术分析cGAS-STING通路激活和ICD效应；建立MC38肿瘤小鼠模型进行体内生物分布、药效学及免疫机制研究，并通过转录组测序（RNAseq）解析分子机制；最后结合anti-PD-1抗体评估联合治疗效果。样本队列来源包括TCGA数据库中的COADREAD数据集、GSE21510和GSE39582数据集、GSE166555单细胞测序数据集，以及收集的人CRC组织样本和C57BL/6J小鼠模型。

**研究结果**

**2.1 结直肠癌中cGAS-STING通路的激活与上调**

通过分析TCGA数据库及GSE21510、GSE39582数据集，研究人员发现STING mRNA在CRC组织中显著高于正常组织，cGAS、TBK1和IRF3 mRNA水平亦升高，STING通路整体活性显著增强。基于GSE166555单细胞测序数据的UMAP分析鉴定出9种主要细胞类型，cGAS、STING、TBK1和IRF3主要富集于上皮细胞，且肿瘤组织中这些基因表达显著高于正常组织。免疫组化证实CRC组织中STING蛋白表达升高，提示靶向cGAS-STING通路是CRC的潜在治疗策略。

**2.2 cDZ@IP纳米颗粒的制备与表征**

ZIF-8和Z@IP通过一步溶剂热法合成，Z@IP保持规则十二面体结构，ICG包封率为14.99%±0.0002%，TPT包封率约98.93%。PDA修饰后表面变粗糙，cRGDfk-PEG2k-NH2进一步功能化得到cDZ@IP。HAADF-STEM-EDS元素 mapping显示Zn、O、N、C均匀分布。FTIR、zeta电位及UV-vis光谱证实PDA和cRGD的成功修饰。ZIF-8、Z@IP和cDZ@IP的平均粒径分别为186.1±2.7 nm、227.3±3.4 nm和248.3±5.9 nm。XPS显示cDZ@IP中Zn 2p结合能降低，有利于治疗过程中Zn²⁺的释放。

**2.3 cDZ@IP的刺激响应性能**

模拟TME条件（pH 5.8）下，cDZ@IP发生显著降解，Zn²⁺释放量约为pH 7.4条件下的5.69倍。PDA介导的巯基反应使cDZ@IP有效耗竭GSH，20 μg mL^-1处理2 h使GSH降低约43%。NIR照射下TPT累积释放率达42%±3.01%，三重刺激（酸性pH+GSH+NIR）下Zn²⁺释放达2007.5±22.5 μg。ICG在纳米颗粒完整时光动力活性被猝灭，降解后单线态氧（¹O₂）产生显著增强。cDZ@IP表现出浓度和激光功率依赖的光热转换性能，光热转换效率为51.58%，且具有良好的光热稳定性。

**2.4 cDZ@IP纳米颗粒的细胞摄取与抗肿瘤效应**

PDA涂层显著改善了ZIF-8的生物相容性。cRGD修饰使MC38细胞对cDZ@IP的摄取效率提高约2倍。纳米颗粒在溶酶体酸性环境中实现溶酶体逃逸。细胞内GSH被有效耗竭，Zn²⁺水平显著升高并在8 h时定位于线粒体。cDZ@IP+L组产生最强ROS信号，较cDZ@P+L组提升38%。线粒体膜电位检测和Bio-TEM观察证实cDZ@IP+L引起最严重线粒体损伤。该组细胞存活率急剧下降，凋亡/晚期凋亡细胞比例从对照组的5.36%升至77.3%。

**2.5 NIR激光照射下cDZ@IP诱导的体外cGAS-STING激活与ICD效应**

cDZ@IP+L组表现出最强的γ-H2AX荧光信号，胞质dsDNA水平较其他组高至少20.4%。纳米载体递送的TPT较游离TPT产生更显著的DNA损伤。ELISA检测显示cDZ@IP+L组cGAMP和STING水平显著升高，Western blot证实p-TBK1和p-IRF3表达上调，IRF3核转位增加。CXCL10和IFN-β水平分别升高至对照组的7倍和7.2倍。CRT膜暴露和HMGB1释放证实ICD发生，ATP分泌增加。Transwell实验显示DC成熟率显著提高，IL-6和TNF-α分泌增多。

**2.6 cDZ@IP体内生物分布与STING介导的抗肿瘤免疫治疗**

Cy7.5标记的cDZ@IP在肿瘤部位呈现强且持续的荧光信号，半衰期t_1/2为8.66 h，主要经肾清除。cDZ@IP+L治疗18天后平均肿瘤体积仅260.6 mm³，肿瘤抑制率达92.15%，显著延长生存期，且主要器官H&E染色显示无毒性。该组肿瘤中CRT暴露和HMGB1释放增加，成熟DC比例达42.2%，CD8⁺ T细胞浸润显著增强，IFN-β和CXCL10水平分别升高13.84倍和3.71倍。

**2.7 cDZ@IP激活STING通路的免疫治疗机制**

转录组分析显示cDZ@IP+L组有151个上调基因和438个下调基因。GO分析富集于免疫相关通路，KEGG分析涉及细胞因子-细胞因子受体互作、趋化因子信号通路、胞质DNA感知通路和NF-κB信号通路。GSEA显示细胞因子信号和嗜中性粒细胞脱颗粒显著富集，关键基因包括干扰素刺激基因（如Nos2）、促炎细胞因子、白细胞招募趋化因子及T细胞或DC活化标志物。

**2.8 cDZ@IP激活STING通路介导的全身抗肿瘤应答评估**

在双侧肿瘤模型中，cDZ@IP+L联合αPD-1几乎完全根除原发肿瘤，有效控制远端肿瘤并预防肺转移，实现长期生存。联合治疗组成熟DC比例最高（65.9%），CD4⁺/CD8⁺ T细胞浸润最强，GZB⁺CD8⁺、IFN-γ⁺CD8⁺和Perforin⁺CD8⁺ T细胞显著增加，效应记忆T细胞和中心记忆T细胞比例升高，血清IL-6、IL-12和TNF-α水平显著上升。

**结论**

该研究成功开发了TME/NIR双响应的锌基靶向纳米激动剂cDZ@IP，实现了纳米代谢物驱动的STING通路多模态协同激活。cDZ@IP在肿瘤特异性条件下精准降解，通过ICG产生ROS诱导线粒体应激释放mtDNA，低剂量TPT（仅为标准剂量的1/16）增强DNA损伤，协同Zn²⁺过载放大cGAS-STING通路激活，mPTT促进ICD。该策略不仅抑制原发肿瘤，还能抑制转移并建立长期免疫记忆，与免疫检查点阻断联合应用显著增强治疗效果，促进"冷"肿瘤向"热"肿瘤转化。该研究为纳米医学与肿瘤免疫治疗的交叉融合提供了新范式，具有重要的转化应用前景。