通过Lyso-PC C-16修饰的脂质纳米颗粒（LNP）实现CD28 siRNA的肿瘤特异性递送，以重塑肿瘤微环境（TME）并克服抗PD-1（Anti-PD-1）耐药性

《Advanced Science》：Tumor-Specific Delivery of CD28 siRNA via Lyso-PC C-16 Modified Lipid Nanoparticles Overcomes Anti-PD-1 Resistance by Remodeling Tumor Microenvironment

　　

揭示可作为免疫检查点阻断（ICB）新协同靶点的 novel targets是紧迫的临床需求。虽然癌细胞固有CD28通过作为非经典RNA结合蛋白稳定CD274（PD-L1）mRNA来促进免疫逃逸，但在不损害必需T细胞CD28共刺激的前提下抑制该通路仍是一大结构挑战。研究人员报道了基于SM-102的16:0 LPC修饰脂质纳米颗粒（LPC-LNP）的开发，其利用改变的肿瘤脂质代谢实现高度选择性癌细胞转染。通过利用恶性肿瘤细胞固有的 elevated lysophosphatidylcholine acyltransferase（LPCAT）摄取机制，LPC-LNP将Cd28小干扰RNA高效递送至肿瘤细胞，同时严格避免T细胞 sequestation。体内给药LPC-LNP-Cd28成功敲低约80%癌细胞CD28，大幅降低PD-L1表达，并规避了市售脂质制剂观察到的脱靶免疫抑制。由此，靶向Cd28沉默重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME），使CD8+T细胞浸润和树突状细胞（DC）活化增至两倍，将小鼠乳腺癌和肺癌模型生存期延长1.3–1.5倍。此外，LPC-LNP-Cd28联合用药有效根除对抗PD-1疗法的耐药性。本研究提供一个高转化性的癌细胞特异性纳米医药平台，证实选择性拮抗肿瘤固有CD28对先进癌症免疫治疗具有重要前景。

论文发表于《Advanced Science》（先进科学）。研究背景方面，免疫检查点阻断（ICB）靶向PD-1（Programmed Cell Death Protein 1）/PD-L1（Programmed Death Ligand 1）轴已深刻改变实体瘤与血液恶性肿瘤的临床管理，但原发与获得性耐药广泛存在，总体客观缓解率低于30%，其机制涉及肿瘤微环境（TME）中恶性细胞主动招募免疫抑制细胞、下调抗原提呈、演化替代免疫逃逸通路等。传统脂质纳米颗粒（LNP）依赖增强渗透滞留效应或载脂蛋白E调理实现被动蓄积，缺乏肿瘤微环境内细胞类型特异性，且siRNA治疗面临核酸酶降解、膜通透性差、组织与细胞特异性递送缺失等障碍。既往研究表明，癌细胞固有胞内CD28可直接结合并稳定CD274 mRNA，促进PD-L1表面表达，驱动免疫逃逸与抗PD-1耐药；但CD28对T细胞活化、增殖与效应功能是绝对必需的共刺激分子，因此系统性抑制CD28必须具备极高的靶细胞特异性，不能扰动T细胞CD28。癌细胞普遍上调脂质合成、清除与重塑通路，Lands循环中lysophosphatidylcholine acyltransferase（LPCAT）家族在各癌种中显著高表达，主动劫持该途径以快速摄取胞外lysophosphatidylcholine（LPC）构建膜结构，这提供了一个可利用的代谢汇。基于此，研究人员开展研究，通过在SM-102基标准四组分LNP中系统性筛选并入Lands循环相关脂质衍生物，发现并入16:0 LPC（1-Palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，即Lyso-PAF C-16）可显著偏移纳米颗粒转染趋向性，优先被高代谢癌细胞摄取而避开免疫细胞（尤其是T细胞），形成癌细胞特异性LPC-LNP平台；利用该平台封装Cd28 siRNA（LPC-LNP-Cd28），在体内外实现肿瘤选择性CD28敲低，下调PD-L1，重塑TME，激活CD8⁺T细胞与cDC1（conventional type 1 dendritic cell），克服抗PD-1耐药，并在多个小鼠肿瘤模型中验证疗效与安全性。

主要关键技术方法：利用公共人乳腺癌、肺癌单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集评估Lands循环基因集（含LPCAT1–4、ACSL3、FASN、SDC1等）的细胞类型特异性；通过微流控混合制备不同摩尔比16:0 LPC修饰的SM-102基LNP（LPC-LNP）与标准商业样四组分LNP（COM-LNP，含SM-102、DSPC、胆固醇、DMG-PEG2000）作对照，进行尺寸、ζ电位、包封率、TEM表征；采用荧光标记siRNA/mRNA评估体外摄取途径（各类内吞抑制剂干预）、Lands循环依赖（LPCAT家族基因敲低）与转染效率；利用小鼠原位移植4T1三阴性乳腺癌（TNBC）、LLC路易斯肺癌、B16F10黑色素瘤模型（样本为6–8周龄雌性BALB/c用于4T1、C57BL/6J用于LLC与B16F10），进行瘤内注射LNP封装Cd28 siRNA或对照siNC，系统腹腔注射抗PD-1（αPD-1）或同型IgG；通过流式细胞术分析肿瘤单细胞悬液免疫表型（淋巴、髓系、Treg等亚群丰度与功能分子）、体外脾细胞转染特异性；通过Q-PCR与Western blot检测Cd28、Cd274及LPCAT家族表达；采用单细胞质谱流式（CyTOF）以淋巴中心与髓系中心抗体面板进行高维免疫谱分析，经Phenograph聚类与UMAP降维解析TME重塑；统计学采用单/双因素ANOVA、t检验、log-rank检验等。

研究结果如下。

2.1 Incorporating 16:0 LPC Into LNPs Improves RNA Uptake and Cancer Cell Specificity：研究人员通过scRNA-seq与小鼠4T1肿瘤分选验证癌细胞Lands循环活性（LPCAT1–4高表达）高于其他TME细胞；高通量筛选发现并入16:0 LPC且摩尔比14%的LNP在4T1细胞中显著提升荧光素酶mRNA转染（12 h达COM-LNP三倍），选定此配方为LPC-LNP；微流控制备的LPC-LNP粒径约150 nm、PDI窄、ζ电位约?2.5 mV、包封率近100%，TEM显示均匀球形无聚集；Cy5-siRNA示LPC-LNP在4T1摄取（MFI）约为COM-LNP四倍，内吞机制依赖clathrin、caveolae（dynasore、chlorpromazine、genistein抑制显著降低摄取，amiloride影响小）且部分依赖LPCAT（LPCAT1–4敲低削弱摄取）；GFP mRNA转染呈剂量与时间依赖性，LPC-LNP最高达COM-LNP19倍（96 h）；体外脾细胞与体内瘤内注射后，LPC-LNP显著减少T细胞、B细胞、NK、DC、单核/巨噬细胞等免疫亚群转染信号，瘤内癌细胞转染效率从COM-LNP的9.5%升至16.0%（约1.7倍），且避开TAM与单核细胞清除；CCK8与活细胞检测显示LPC-LNP无额外细胞毒性。

2.2 LPC-LNP-Delivered Cd28 siRNA Selectively Knocks Down Cancer Cell CD28：体外4T1中LPC-LNP-Cd28与COM-LNP-Cd28均高效敲低Cd28 mRNA与蛋白；但脾细胞处理后COM-LNP-Cd28降低CD4⁺与CD8⁺T细胞表面CD28，LPC-LNP-Cd28完全不影响T细胞CD28；体内4T1瘤模型（接种后第10天起3次瘤内注射）显示两者均同等敲低分选癌细胞Cd28与Cd274 mRNA（印证CD28稳定Cd274机制），COM-LNP-Cd28降低瘤内CD4⁺T细胞CD28而LPC-LNP-Cd28无影响，CD8⁺T细胞CD28均无明显扰动（可能与外周新生T细胞浸润有关）；LLC模型得到一致结果：两者瘤内癌细胞Cd28、Cd274敲低等效，LPC-LNP-Cd28保留T细胞CD28，COM-LNP-Cd28损伤CD4⁺T细胞CD28。证明LPC-LNP-Cd28实现肿瘤选择性Cd28沉默且不波及T细胞CD28。

2.3 Intratumoral Injection of LPC-LNP-Cd28 Inhibits Tumor Growth：在4T1、LLC、B16F10（均抗PD-1耐药“冷”瘤）模型中，瘤内LPC-LNP-Cd28（3次，20 μg siRNA/次）显著抑制肿瘤生长并延长带瘤小鼠生存期，而COM-LNP-Cd28无疗效（4T1与对照组相似，LLC与B16F10无效）；提示癌细胞特异性Cd28沉默（不伤T细胞CD28）是发挥抗肿瘤作用的关键，COM-LNP因脱靶T细胞Cd28沉默丧失疗效。

2.4 Intratumoral Injection of LPC-LNP-Cd28 Activates CD8⁺T Cell Antitumor Immunity：流式分析示LPC-LNP-Cd28（非COM-LNP-Cd28）在4T1与LLC瘤中显著提升CD8⁺T细胞绝对数，增强其IFNγ⁺TNFα⁺、Perforin⁺Granzyme B⁺、IL2⁺活化/细胞毒性表型；CD4⁺T细胞数量未显著改变但功能分子（IFNγ、TNFα、IL2）上调；Treg丰度无一致变化（4T1中不变，LLC中COM-LNP-Cd28反升Treg）；NK与B细胞无稳定改善；髓系方面，LPC-LNP-Cd28促进cDC1（CD103⁺XCR1⁺）与cDC2富集（LLC中cDC2亦升），COM-LNP-Cd28在LLC中反而提升单核、TAM、中性粒细胞（尤neutrophil）；结论为LPC-LNP-Cd28激活CD8⁺T细胞与cDC，重编程免疫抑制TME，COM-LNP-Cd28因T细胞CD28脱靶无法激活CD8⁺T（CD4⁺T需CD28信号助CD8活化）。

2.5 Intratumoral Injection of LPC-LNP-Cd28 Overcomes Anti-PD-1 Immunotherapy Resistance：4T1与LLC模型中，系统αPD-1单药无效，LPC-LNP-Cd28单药抑瘤，而联合LPC-LNP-Cd28＋αPD-1产生强协同效应，进一步抑制肿瘤生长并显著提升生存率（4T1与LLC一致），表明瘤内LPC-LNP-Cd28不仅自身抑瘤，还克服原有αPD-1耐药，实现协同。

2.6 Enhanced Antitumor Immunity In Vivo After Combined LPC-LNP-Cd28/Anti-PD-1 Therapy：CyTOF淋巴中心面板（38抗体）经UMAP与Phenograph得25个CD45⁺簇，LPC-LNP-Cd28＋αPD-1显著提升CD8⁺T与NK比例、降低髓系比例；细分13个淋巴簇显示活化CD8⁺T（簇5，高IFNγ、Ki-67）与细胞毒CD8⁺T（簇13，高Granzyme B）在联合组最富集，CD8⁺T的IFNγ、CD69、Ki-67表达逐次增强（LPC-LNP-Cd28单药已升，联合进一步增强）；Treg簇（簇1为KLRG1⁺终末抑制性强，簇3为KLRG1^?）中KLRG1^?/KLRG1⁺比值联合组升高（阻滞Treg终末分化）；CD4⁺T的IFNγ、Ki-67联合组上调；髓系中心面板（37抗体）得17簇，联合与单药LPC-LNP-Cd28提升cDC1（簇7，CD103⁺XCR1⁺）、CCR7⁺DC（簇5）、cDC2（簇4、6），且这些DC的PD-L1与Arg1表达降低；免疫抑制髓系如TAM（簇11、13）、neutrophil（簇16、17，高IL10、Arg1）在联合组减少，TAM的PD-L1、Arg1也下调；单核（簇12）在单药与联合组略升。结论为联合治疗激活cDC1/CCR7⁺DC与CD8⁺T，削减抑制性髓系与TAM功能，重编程TME为免疫活化状态。

讨论部分总结：研究人员指出，16:0 LPC修饰SM-102基LNP（LPC-LNP）首次通过代谢脂质（非抗体修饰）实现癌细胞特异性靶向，利用肿瘤高LPCAT活性摄取16:0 LPC伪装为代谢燃料，避开免疫细胞；该平台可递送siRNA或mRNA至癌细胞，合成简便低成本。LPC-LNP摄取主要经clathrin/caveolae内吞，macropinocytosis贡献小，可能涉及膜融合等机制待研；内体逃逸是否受16:0 LPC影响亦待阐明。COM-LNP-Cd28虽敲低癌细胞Cd28/Cd274却脱靶沉默T细胞Cd28（尤其CD4⁺T），丧失CD28共刺激信号故无法激活CD8⁺T、无疗效，凸显同一靶点在不同细胞功能迥异时需细胞类型特异性递送的重要性；此类平台亦可拓展至其他具细胞类型特异功能的靶点（如SIRPα）。LPC-LNP-Cd28下调癌细胞PD-L1，活化cDC1与CD8⁺T，将“冷”瘤变“热”，联合αPD-1克服耐药；CyTOF示联合治疗提升KLRG1^?Treg/KLRG1⁺Treg比值（阻滞Treg终末分化），可能因癌细胞PD-L1下调削弱PD-1/PD-L1驱动Treg分化，且髓系抑制细胞减少打断Treg-髓系正反馈环。综上，16:0 LPC修饰LNP是代谢导向癌细胞特异性纳米载体，选择性递送Cd28 siRNA体内敲低肿瘤CD28，重塑TME，激活CD8⁺T，抑瘤并克服抗PD-1耐药；研究为癌细胞特异性LNP开发提供洞见，确立肿瘤固有CD28为可靶向突破免疫逃逸与ICB耐药的分子，具有高临床转化价值。