探究麝香保心丸(Shexiang Baoxin Pill, SBP)治疗缺血性卒中(Ischemic Stroke, IS)的作用机制：一项整合网络药理学、机器学习、分子对接与分子动力学模拟的研究

《BioMed Research International》：Exploring the Mechanism of Shexiang Baoxin Pill in the Treatment of Ischemic Stroke: A Study Integrating Network Pharmacology, Machine Learning, Molecular Docking, and Molecular Dynamics Simulation

　　

摘要：缺血性卒中（Ischemic Stroke, IS）是全球范围内致死和长期致残的主要原因，与心血管疾病（Cardiovascular Disease, CVD）密切相关。其发病机制与心血管疾患重叠，尤以动脉粥样硬化及免疫–炎症失调为著。麝香保心丸（Shexiang Baoxin Pill, SBP）为临床用于治疗冠心病与心绞痛的传统中药复方，既往报道显示其可改善微循环并减轻炎症反应，然而SBP抗IS的具体机制尚不清楚。本研究采用整合网络药理学、机器学习、分子对接及分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulation, MD Simulation）的策略，探讨SBP干预IS的潜在机制。研究共鉴定SBP活性成分126个及其潜在靶点796个。通过与GEO数据集中IS相关差异表达基因取交集，获得6个候选靶标：CXCL8、IL1B、JUN、NR4A2、PTGS2及TNF。功能富集分析提示上述靶标主要参与心脑血管相关过程，包括炎症反应、免疫调节及细胞凋亡。结合蛋白–蛋白互作（Protein–Protein Interaction, PPI）网络分析与机器学习进一步确定TNF与JUN为IS相关枢纽基因（Hub Genes）。分子对接与分子动力学模拟表明代表性活性成分（如蟾毒灵bufalin和蟾毒它灵bufotalin）与两个枢纽靶标有稳定结合，且TNF–化合物复合物在模拟过程中结构保持稳定。综上，本计算学研究提示SBP可能通过涉及炎症与免疫相关通路的多成分、多靶标调控网络发挥IS治疗作用，为SBP脑血管保护作用的进一步实验验证提供了初步分子证据与理论基础。

麝香保心丸治疗缺血性卒的网络药理学与多组学整合计算研究解读

该研究发表于《BioMed Research International》。缺血性卒中（Ischemic Stroke, IS）占卒中总数的70%以上，是致死与长期致残的首要原因，其病理 cascade涉及能量衰竭、兴奋性毒性、氧化应激及神经炎症，并与全身性心血管病变（动脉粥样硬化、内皮功能障碍）共享"心–脑血管连续统（heart–brain vascular continuum）"病理基础。现有再灌注疗法（静脉溶栓、机械取栓）受严格时间窗与适应证限制，常规神经保护手段对缺血后神经元恢复的直接获益有限，亟需能调控IS复杂病理网络的新策略。麝香保心丸（Shexiang Baoxin Pill, SBP）是源于经典方的上市中成药，临床用于冠心病心绞痛，具改善微循环、抗炎等作用，文献提示其对IS模型有改善认知与运动缺陷、抑制神经元凋亡及促进突触可塑性的潜力，但其作用于IS的分子靶点与系统机制未明。研究人员采用整合计算框架探讨SBP干预IS的潜在分子机制，得出结论：SBP活性成分可能通过调控TNF与JUN为核心节点的炎症–免疫相关多靶标网络发挥IS治疗潜力，为"心脑同治"提供分子层面的理论依据。

主要关键技术方法：研究人员以TCMSP、HERB、PubChem、SwissADME及SwissTargetPrediction筛选SBP七味药材（人参、牛黄、肉桂、苏合香、冰片、麝香、蟾酥）中符合口服生物利用度OB≥24%、类药性DL≥0.09或高胃肠道吸收及Veber等五类类药规则中至少三项的活性成分并预测人源靶点；从GEO数据库获取训练队列GSE22255（20例健康对照+20例IS）与独立验证队列GSE16561（24例健康对照+39例IS），以|log₂FC|>1.5且p<0.05筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），并从DrugBank、GeneCards（相关性评分>0.865）、CTD、TTD及NCBI搜集IS疾病相关基因，三者取交集得候选靶标；构建药物–成分–疾病靶标网络及STRING-PPI网络，经Cytoscape拓扑分析筛选枢纽节点；采用LASSO回归、支持向量机–递归特征消除（Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination, SVM-RFE）及随机森林（Random Forest, RF）三种机器学习算法交叉筛选核心基因，并在验证队列做ROC曲线评估诊断效能；用CIBERSORT反卷积估算22种免疫细胞亚群浸润丰度；将最高亲和力活性成分配体与靶蛋白（TNF PDB ID:5UUI；JUN PDB ID:5T01）用AutoDock进行分子对接验证，并以AMBER24软件包对优选蛋白–配体复合物行100 ns分子动力学模拟及MM/GBSA（分子力学/广义波恩表面积法，Molecular Mechanics/Generalized Born Surface Area）结合自由能计算。

3.1. Identification of Active Components and Targets of SBP（SBP活性成分与靶点的鉴定）：研究人员从SBP七味药材中筛选出126个符合标准的非重复活性成分（麝香19个、人参47个、牛黄8个、肉桂13个、苏合香13个、蟾酥21个、冰片5个），对应去重后潜在靶点796个，体现中药复方多成分–多靶点多态分布特征。

3.2. Identification of IS-Related Targets and DEGs（IS相关靶点与差异表达基因的鉴定）：对GSE22255做差异分析获34个IS相关DEGs（33个下调、1个上调），从多数据库整合去重获2360个IS疾病相关基因，再与DEGs及SBP靶标取交集，最终锁定6个交汇基因：CXCL8、IL1B、JUN、NR4A2、PTGS2及TNF，作为SBP干预IS的候选治疗靶标。

3.3. Compound–Target Network Analysis（成分–靶标网络分析）：构建含药物、活性成分、候选靶标及疾病的多维网络，筛选出连接度较高的5个核心活性成分（ChemSpider ID:9839即bufotenine/蟾色胺、ChemSpider ID:7826155即bufalin/蟾毒灵、MOL001600即copaene/古芸烯、MOL000422即kaempferol/山奈酚、ChemSpider ID:16735710）；Sankey图显示bufalin和bufotenine可与多靶标同时作用，提示较强多靶标关联潜力。

3.4. PPI Network Analysis of IS-Related Genes（IS相关基因的蛋白–蛋白互作网络分析）：将6个交汇基因导入STRING构建PPI网络（6节点14边），经多中心性指标（度、介数、接近中心性、特征向量中心性等）拓扑分析筛出含4个候选核心靶标的子网络，提示其在互作网络中具较高连通重要性。

3.5. GO and KEGG Enrichment Analyses（GO与KEGG富集分析）：GO分析显示候选靶标显著富集于炎症反应正调控、细胞因子介导信号通路（生物学过程BP），胞质核糖体（细胞组分CC），细胞因子受体结合及信号受体激活剂活性（分子功能MF）；KEGG富集显示TNF、PTGS2、IL1B映射至TNF信号通路、IL-17信号通路及Toll样受体（Toll-Like Receptor, TLR）信号通路等促炎通路，与GO炎症主题一致。

3.6. Identification of Core Hub Genes Using Machine Learning Approaches（基于机器学习的枢纽核心基因识别）：分别用LASSO（λ由十折交叉验证选定）、SVM-RFE及RF建模，RF的OOB误差约0.45趋于稳定，特征重要性排序给出各基因权重；三种算法共同筛选出的交叠基因为TNF与JUN，定义为IS特异性核心基因。

3.7. Validation and Diagnostic Performance of the Selected Genes（所选基因验证与诊断效能评价）：训练队列中JUN（AUC=0.750）与TNF（AUC=0.725）及联合基因组合（AUC=0.750）具中等判别力；验证队列中TNF维持较稳定AUC=0.728，JUN降至AUC=0.573，联合组合AUC=0.698，提示TNF跨队列表达表现相对稳定，JUN对判别增益有限。

3.8. GSEA of the Two Key Targets（两关键靶基因集富集分析）：对TNF与JUN做基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA），显著富集TLR、NOD样受体（NOD-Like Receptor, NLR）、丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK）信号通路、细胞因子–细胞因子受体相互作用、T细胞受体信号通路等，提示先天免疫失调及炎症介质释放与IS进展相关联。

3.9. Immune Cell Infiltration Analysis（免疫细胞浸润分析）：CIBERSORT显示IS样本中M1/M0巨噬细胞、滤泡辅助T细胞、调节性T细胞（Regulatory T Cells, Tregs）及活化树突状细胞比例升高（p<0.05），IS组倾向以固有免疫细胞为主伴适应性免疫细胞相对减少；TNF与JUN表达量与特定免疫细胞亚型呈相关性，暗示其可能参与缺血后炎症微环境免疫调节。

3.10. Molecular Docking Validation（分子对接验证）：代表性活性成分与TNF（网格盒中心45.3,52.929,13.77 ?）及JUN（网格盒中心?23.326,17.31,20.956 ?）对接，bufalin对TNF结合能?6.63 kcal/mol、对JUN?6.31 kcal/mol，属中等强度结合；其余成分亦呈中等/弱负结合能。对接模式显示潜在氢键、疏水接触及π–π堆积作用，与已知TNF抑制剂SPD-304及JUN抑制剂SP600125文献范围可比。

3.11. MD Simulation（分子动力学模拟）：100 ns MD显示TNF–配体复合物骨架RMSD（根均方偏差，Root Mean Square Deviation）稳定在0.1–0.2 nm，半径回旋（Radius of Gyration, Rg）与溶剂可及表面积（Solvent-Accessible Surface Area, SASA）反映较致密构象，维持1–3个氢键；JUN–配体复合物RMSD≈0.35 nm波动较大（bZIP结构域柔性），但未发生配体解离。MM/GBSA计算显示TNF–bufalin结合自由能最有利，关键残基Ala80与Asp86贡献稳定性；自由能景观（Free Energy Landscape, FEL）示TNF复合物低能态更集中。

讨论与结论翻译：讨论部分指出，IS复杂的神经炎症、氧化应激、凋亡及血管功能障碍互作使单靶点药物受限，而SBP多成分特性可系统调控炎症–免疫网络。PPI与三种机器学习一致指向TNF（关键炎性介质，参与内皮功能障碍、血脑屏障破坏及再灌注损伤）和JUN（AP-1转录复合体组份，调控应激基因表达、凋亡及炎症信号）为核心节点，免疫浸润分析示其与巨噬细胞及树突状细胞等变化相关。蟾酥中bufalin/bufotalin抑制TLR4/NF-κB/NLRP3轴及促炎因子生成的文献报道与本研究预测互作模式吻合。整合多数据库与双队列交叉验证增强计算框架稳健性，但也承认局限：属纯生信与计算预测（无细胞/动物实验验证），不同数据库与转录组平台异质性可引入偏倚。结论：本研究应用整合网络药理学、生物信息学与机器学习策略探究SBP干预IS的潜在机制，结果表明SBP关联靶标显著富集于炎症与免疫相关通路，TNF与JUN被确定为连接SBP心血管作用与IS神经保护的关键分子节点。这些发现为SBP多靶标药理效应提供了计算学依据，鉴于结果源自计算机模拟分析，尚需进一步实验与临床研究验证所述观察结果的生物学相关性及治疗潜力。