β2-肾上腺素受体激动剂特异性构象动力学决定Gαs信号转导及支气管扩张的变构调节（Agonist-specific conformational dynamics at the β2-adrenoceptor dictate allosteric modulation of Gαssignalling and bronchodilation）

《British Journal of Pharmacology》：Agonist-specific conformational dynamics at the β2-adrenoceptor dictate allosteric modulation of Gαs signalling and bronchodilation

　　

背景与目的：β2-肾上腺素受体（β2-adrenoceptor，β2AR）激动剂是哮喘治疗的基础用药，通过在气道平滑肌（airway smooth muscle，ASM）中激活Gαs信号引起支气管扩张，但其疗效受β-arrestin介导的β2AR脱敏所限。研究人员此前发现一类β2AR的变构调节剂（allosteric modulators，AMs），可选择性增强异丙肾上腺素（isoproterenol）诱导的β2AR–Gαs信号。正位（orthosteric）β-激动剂在效能、动力学及信号偏向性上存在差异，这种多样性如何影响β2AR的变构调节尚不清楚。本研究探讨AMs是否能选择性调节内源及临床常用β-激动剂所诱导的β2AR–Gαs信号及支气管扩张。 实验方法：研究人员采用阳性变构调节剂PAM37及两种阴性变构调节剂NAM36、NAM42，检测其对表达人β2AR的HEK293细胞及原代人ASM细胞中β-激动剂诱导的Gαs及β-arrestin募集和下游信号（cAMP、PKA及ERK）的影响；采用小鼠精密切片肺（precision-cut lung slices，PCLS）及在体肺功能评估支气管扩张效应；通过分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟阐明激动剂依赖的AM活性结构基础。 主要结果：PAM37增强而NAMs减弱β2AR–Gαs偶联、信号及支气管扩张，且不影响β-arrestin–ERK信号，表现出Gαs信号及功能偏向性。AMs对不同β-激动剂的调节幅度及动力学特征各异，其中非诺特罗（fenoterol）对变构调节完全抵抗。MD模拟显示非诺特罗稳定一种类失活β2AR构象，其特征为跨膜螺旋6（transmembrane helix 6，TM6）发生位移使变构口袋被封堵，从结构上解释了其抵抗性。 结论与意义：本研究确立正交配体依赖性变构是β2AR药理学的基本特性。PAM37可作为工具化合物选择性增强哮喘治疗中β-激动剂的支气管扩张作用。

本研究发表于《British Journal of Pharmacology》。

【研究背景】

β₂-肾上腺素受体（β₂-adrenoceptor，β₂AR）激动剂是哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）支气管扩张治疗的一线药物，通过激活Gα_s（stimulatory G protein alpha subunit）–腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase，AC）–cAMP–蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路引起气道平滑肌（airway smooth muscle，ASM）舒张。但长期应用可诱发β-arrestin介导的受体脱敏与内化，削弱疗效。不同β-激动剂（内源性儿茶酚胺及合成短效/长效β₂AR激动剂，SABA/LABA）因结合模式差异可稳定不同的受体构象状态，产生各异的信号效能与偏向性。研究人员此前发现一类Gα_s偏向性β₂AR变构调节剂（allosteric modulators，AMs），其中正向变构调节剂（positive allosteric modulator，PAM）PAM37可选择性增强异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）诱导的cAMP生成而不影响β-arrestin通路，但其是否对多种β-激动剂均具调节效力及机制不明。本研究旨在明确正交配体（orthosteric ligand）多样性是否以及如何决定β₂AR的变构调制效果。

【主要关键技术方法】

研究人员以稳定转染人β₂AR的HEK293细胞及原代人ASM细胞为模型，采用ELISA检测细胞内cAMP水平；以BRET（bioluminescence resonance energy transfer，生物发光共振能量转移）法检测β₂AR与Gα_s或β-arrestin2的实时偶联/募集；Western blot检测PKA底物VASP（vasodilator-stimulated phosphoprotein）磷酸化及ERK磷酸化；放射性配体竞争结合实验验证变构调节剂对芬诺特罗（fenoterol，FEN）结合亲和力的影响；以小鼠精密切片肺（precision-cut lung slices，PCLS）离体评估气道舒张，以flexiVent系统在体测定雾化β-激动剂联合AM处理后的小鼠气道阻力变化；对ISO与FEN结合的β₂AR进行500 ns分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟，分析跨膜螺旋间距及变构口袋几何变化。

【研究结果】

3.1 Allosteric modulators demonstrate agonist specificity in modulating cAMP generation（变构调节剂表现出对cAMP生成的激动剂特异性调节）

在HEK293细胞及原代人ASM细胞中，PAM37增强ISO、福莫特罗（formoterol，FORM）、沙丁胺醇（albuterol，ALB）、沙美特罗（salmeterol，SALM）、肾上腺素（adrenaline，EPI）、去甲肾上腺素（noradrenaline，NorEPI）及特布他林（terbutaline，TERB）诱导的cAMP生成，NAM36和NAM42则抑制之；FEN诱导的cAMP不受任何AM影响。表明AM对β₂AR–cAMP信号的调节具有正交配体依赖性。

3.2 β-agonist-induced vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) phosphorylation is augmented by PAM37（PAM37增强β-激动剂诱导的VASP磷酸化）

PAM37可增强除FEN和SALM外各β-激动剂诱导的VASP（PKA下游底物）磷酸化，FEN组无变化，与cAMP结果一致，证实AM选择性调控Gα_s–PKA轴。

3.3 Allosteric modulators do not modulate β-agonist-mediated β-arrestin recruitment to the β₂-adrenoceptor or ERK activation（变构调节剂不调节β-激动剂介导的β-arrestin募集或ERK活化）

BRET及Western blot显示所有β-激动剂均可诱导β-arrestin2募集及ERK磷酸化，但AMs对此无影响，证实AMs具有Gα_s信号偏向性（Gα_s-biased modulation）。

3.4 PAM37 augments and NAM36 and NAM42 inhibit β-agonist-mediated bronchodilation（PAM37增强、NAM36和NAM42抑制β-激动剂介导的支气管扩张）

小鼠PCLS实验中，PAM37显著增强ISO、FORM、ALB、SALM、EPI、TERB引起的气道腔面积增加（支气管扩张），NAMs抑制之，FEN不受影响。AM主要改变最大效应（E_max）而非半数有效浓度（EC₅₀）。

3.5 PAM37 enhances β-agonist-mediated bronchodilation in vivo（PAM37在体增强β-激动剂介导的支气管扩张）

在MCh（methacholine）致支气管收缩的小鼠模型中，雾化给予ISO、FORM、ALB或SALM联合PAM37，PAM37显著降低气道阻力，增强上述激动剂的在体支气管扩张效应。

3.6 Allosteric modulator modulate Gαs-protein binding to the β₂-adrenoceptor upon agonist stimulation（变构调节剂调节激动剂刺激下Gα_s与β₂AR的结合）

BRET Gα_s偶联实验显示PAM37增强、NAMs减弱多数β-激动剂诱导的Gα_s–β₂AR相互作用（FEN除外），说明AM作用于受体–G蛋白偶联水平。

3.7 Kinetic analysis of β-agonist-induced Gαs coupling to the β₂-adrenoceptor and its modulation by allosteric modulators（β-激动剂诱导Gα_s偶联的动力学分析及变构调节剂的调制）

不同β-激动剂具独特Gα_s偶联动力学特征（峰高、曲线下面积AUC、激活速率等），经主成分分析（PCA）与聚类可分群。PAM37使多数激动剂的激活速率加快、AUC及峰值升高；NAMs则降低这些参数；FEN的动力学特征不受AM影响，表明AM重塑受体激活的时间动力学。

3.8 Allosteric modulators do not alter the binding affinity of fenoterol to the β₂-adrenoceptor（变构调节剂不改变芬诺特罗与β₂AR的结合亲和力）

[³H]DHA竞争结合实验显示FEN可浓度依赖性置换放射配体，AM共存不改变其结合曲线，排除"AM影响FEN正交结合"的可能。

3.9 Computational modelling reveals differences in allosteric pocket availability in isoproterenol- and fenoterol-bound β₂-adrenoceptor（计算建模揭示ISO与FEN结合β₂AR时变构口袋可及性的差异）

MD模拟显示ISO结合使离子锁（ionic lock，Arg^3.50₁₃₁–Glu^6.30₂₆₈）距离增大至约16.4 ?，TM6外移，变构口袋开放；FEN结合仅使离子锁距离增至约12.3 ?，TM6内收使变构口袋变窄甚至封闭，阻碍AM结合——从结构动力学上解释FEN抵抗变构调节的机制。

3.10 Allosteric modulators selectively modulate Gαs-cAMP-PKA signalling and bronchodilation without affecting the β-arrestin pathway（变构调节剂选择性调节Gα_s–cAMP–PKA信号与支气管扩张但不影响β-arrestin通路）

雷达图整合各激动剂下Gα_s偶联、cAMP、β-arrestin募集及支气管扩张数据，显示PAM37一致上调Gα_s–cAMP–支气管扩张（FEN除外），NAMs下调之，β-arrestin轴不受扰，确认AM的Gα_s偏向性功能选择性。

【讨论与结论】

讨论指出本研究首次系统比较八种内源及临床β-激动剂在Gα_s偏向性AM作用下的信号与功能响应，证实变构调节效果取决于正交配体所稳定的受体构象。FEN因诱导TM6内移使变构口袋不可及而对AM免疫，不同于此前报道可调节FEN信号的变构化合物Cmpd-6（结合位点不同）。本研究所用AMs结合于由Arg^3.50₁₃₁、Tyr^5.58₂₁₉、Phe^{6.44₂₈₂界定之胞内深跨膜区变构口袋，且具独特的Gα_s选择性——不干扰β-arrestin通路，理论上可在降低β-激动剂用量情况下维持或增强支气管扩张，减少β-arrestin介导脱敏风险。}

结论翻译：本研究表明β₂AR变构调节剂表现出明显的激动剂特异性——可增强或抑制多种β-激动剂所诱导的Gα_s–cAMP–PKA通路及支气管扩张，其中非诺特罗（fenoterol）对变构调节呈独特抵抗性。重要的是，此种调节偏向Gα_s通路，不影响β-激动剂诱导的β-arrestin募集或β-arrestin介导的信号，与研究人员此前的筛选结果一致。此外，PAM37在离体及在体条件下均能增强多种β-激动剂的支气管扩张反应，凸显了Gα_s偏向性变构调节剂的治疗潜力。正交配体依赖性是β₂AR药理学的基本特征，PAM37可作为工具化合物用于选择性增强阻塞性气道疾病中β-激动剂的支气管扩张疗效。