合成与评估芳族磺酰胺和二磺酰胺衍生物作为登革病毒NS3-NS5相互作用抑制剂

《ChemMedChem》：Synthesis and Evaluation of Aromatic Sulfonamide and Disulfonamide Derivatives as Dengue Virus NS3–NS5 Interaction Inhibitors

　　

新出现的病毒威胁凸显了针对病毒复制机制的抗病毒药物的迫切需求。基于先前的研究，研究人员扩展了一系列不对称苯-1,4-二磺酰胺（asymmetric benzene-1,4-disulfonamides）。由于这些化合物合成具有挑战性且通常毒性高于预期，研究人员通过省略一个磺酰胺基团优化了一个先导结构（hit structure）。所得化合物兼具微摩尔抗病毒效力、低毒性和简便的合成路线。分子对接（Molecular docking）和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）证实该化合物靶向登革病毒-2的NS5 RNA聚合酶结构域（NS5 RNA polymerase domain），阻断其与NS3的相互作用，从而抑制病毒复制。一系列聚焦的结构类似物进一步证明了先导分子（hit molecule）每个单独部分的重要贡献。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
尽管COVID-19大流行已过去数年，但其影响仍然深刻，凸显了社会对新发和再发病毒准备不足的短板。气候变化、全球旅行和城市化等因素为病毒扩散提供了有利环境，尤其值得关注的是正黄病毒属（orthoflaviviruses），包括登革病毒（dengue virus, DENV）、寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）、西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）和黄热病毒，它们主要由伊蚊传播。近期，全球变暖和环境变化导致埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）的地理分布扩大，不再局限于热带和亚热带地区。因此，开发针对黄病毒科（Flaviviridae）多个成员共有生命周期的抗病毒药物，不仅在科学上合理，从公共卫生角度看也刻不容缓。正黄病毒在复制周期关键蛋白（如NS3和NS5）上共享许多结构元件，这为利用单一治疗剂抑制多种病毒提供了可能。已有研究报道了靶向NS5、NS4B蛋白、NS2B/NS3蛋白酶/解旋酶或它们之间相互作用的抗黄病毒药物。其中，NS3解旋酶结构域与NS5 RNA依赖性RNA聚合酶结构域（RNA-dependent RNA polymerase domain, RdRp）的相互作用备受关注。Cannalire等人发现小分子与NS5结合可通过同时阻断NS3-NS5复合物形成和NS5-RNA相互作用产生双重抑制。计算机筛选发现化合物A（Compound A）对四种DENV血清型及WNV、ZIKV具有低微摩尔活性且无毒。然而，化合物A含有两个处于芳香环1,4-位的磺酰胺基团，合成困难，且其中一个磺酰胺基团带有手性中心，增加了药物开发难度。

**本研究开展的内容与意义**
针对上述问题，研究人员首先发展了一条合成不对称苯-1,4-二磺酰胺的新路线，制备了化合物A的一系列类似物（Series 1），但发现这些化合物毒性高于预期。随后，通过计算机辅助结构合理化，研究人员优化了先导结构，省略一个磺酰胺基团并去除手性中心，得到了化合物2a。该化合物兼具微摩尔抗病毒活性、低毒性和从廉价原料出发的简便合成。分子对接和ELISA实验证实化合物2a靶向DENV-2 NS5 RdRp结构域，阻断其与NS3的相互作用，从而抑制病毒复制。进一步的结构类似物系列明确了分子中各个基团的必要贡献。这项研究为开发具有泛黄病毒谱的抗病毒药物提供了重要进展，论文发表在《ChemMedChem》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用的主要关键技术包括：分子建模（Molecular Modeling），基于DENV NS5蛋白结构（PDB: 5K5M）进行对接模拟，使用Glide标准精度（SP）和额外精度（XP）模式以及Autodock Vina，结合MMGBSA（Molecular Mechanics/Generalized Born Surface Area）计算评估结合亲和力；生物学评价中，在非洲绿猴Vero细胞系（购自美国模式培养物保藏所，ATCC VR-CCL-81）上对DENV-2 NGC株（由英国公共卫生局NCPV提供）进行空斑减少试验（Plaque reduction assays）测定抗病毒活性，通过MTT法测定细胞毒性；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测化合物阻断NS3-NS5相互作用的能力。合成部分使用了二苯二硫醚的氯磺化、氧化及Buchwald-Hartwig偶联等策略。

**研究结果**
**2.1 Series 1**：为了克服化合物A的合成难题，研究人员开发了以二苯二硫醚为起始原料的新合成路线，通过氯磺化、氧化、与二乙胺反应得到对称磺酰胺中间体4，再经氧化和与不同杂环取代的N-苯基甘氨酰胺胺类8a–d反应，制备了4个不对称苯-1,4-二磺酰胺类似物（1a–d）。生物学测试显示，化合物1a毒性高（CC₅₀ = 4.6 μM），未进一步研究；1b（含N-甲基吡咯基）选择性指数（SI）为4，EC₅₀ = 17.5 μM；吡啶衍生物1c和1d毒性较大且活性低（EC₅₀ > 25 μM）。该系列化合物整体毒性高于预期。
**2.2 Series 2**：基于分子对接分析，化合物A中磺酰胺基团和手性异丁基与蛋白无显著相互作用，而酰胺氧与Lys330、酰胺NH与Gln869是关键作用。因此研究人员省略一个磺酰胺基团，保留弯折分子形状，将异丁基替换为两个乙基，设计出化合物2a。对接显示2a中呋喃基深入结合口袋，与Gln869、Ala866、Trp859产生疏水相互作用，而苯基暴露于口袋外；关键相互作用（Lys330和Gln869）得以保留。进一步设计了类似物2b–h，MMGBSA计算表明2a结合亲和力最高，任何关键基团的缺失均降低结合力。为此，研究人员以易得的对氨基苯基-N,N-二乙基磺酰胺10为关键中间体，通过还原胺化、烷基化等步骤合成了化合物2a及系列类似物2b–h；还发展了基于Buchwald-Hartwig偶联的替代合成路线（虽产率中等）。生物学评价表明，化合物2a和2b保留微摩尔抗病毒活性（EC₅₀分别为8.6 μM和14.1 μM），且毒性低（CC₅₀ > 125 μM，SI>15和>8）。去除酰胺基团的2b活性未丧失，但去除或替换呋喃-2-基甲基的2c–f活性急剧丧失（EC₅₀ > 25 μM）。吡啶衍生物2g和2h无显著活性。NS3-NS5 ELISA实验证实，2a可有效干扰NS3-NS5相互作用（IC₅₀ = 75 μM），而2b无活性（IC₅₀ > 500 μM），提示2b可能通过不同机制发挥作用。

**总结讨论与结论**
研究结论指出：不对称苯-1,4-二磺酰胺的制备曾是潜在抗病毒化合物合成的瓶颈，通过发展基于二苯二硫醚衍生化及随后S-S键氧化的合成策略，成功扩展了此类化合物库，但发现其毒性高于预期。计算机辅助结构合理化（省略一个磺酰胺基团）导向了优化化合物2a的开发，它保持微摩尔效力、低毒性，且可从廉价原料简便合成。分子对接研究（由ELISA实验支持）表明化合物2a占据DENV NS5 RdRp结构域的结合口袋，从而阻止其与NS3的相互作用及随后的病毒RNA复制。同时，对先导化合物系列类似物的评估明确证实了苯胺部分两个取代基——2-氧代-2-(苯基氨基)乙基和呋喃-2-基甲基——的必要性：前者负责与蛋白的强相互作用，后者可能确保磺酰胺部分的正确定位，从而有效阻断蛋白-蛋白相互作用界面。由于NS5结构在黄病毒科中高度保守，这一新化合物是开发具有泛黄病毒谱抗病毒药物的重要一步，有助于对抗新出现和传播中的黄病毒。