新型DNA旋转酶抑制剂类别的优化以提升抗菌活性

《ChemMedChem》：Optimisation of a Novel Class of DNA Gyrase Inhibitors to Improve Antibacterial Activity

　　

随着抗生素耐药性持续上升，对新抗生素的需求显而易见。在此背景下，革兰氏阴性菌因其多种可能的耐药机制和独特的外膜而构成特定挑战。外膜渗透性差限制了多种抗生素的活性。这导致人们对识别能够增强小分子抗生素跨越革兰氏阴性外膜能力的结构特征越来越感兴趣。此类方法的例子包括引入可电离的胺以促进摄取，以及连接铁载体（siderophore）部分以利用细菌的铁转运系统。在此，研究人员将这些策略应用于一类新发现的强效DNA旋转酶（DNA gyrase）抑制剂——异喹啉磺酰胺（isoquinoline sulphonamides），以化合物LEI-800为典型代表，旨在增强其革兰氏阴性活性。为此，研究人员在LEI-800支架的远端芳环上功能化引入了伯胺、胍和铁载体部分。这些研究表明，在LEI-800支架的选定位置引入可电离的胺基是可容忍的，从而增加了抗菌活性并减轻了膜渗透性障碍。

**论文解读：新型DNA旋转酶抑制剂的优化及其抗菌活性提升研究**

**1. 研究背景与问题**

抗生素耐药性持续攀升，成为全球健康重大威胁。尤其是革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌），因其独特的外膜屏障和高效外排泵系统，导致现有抗生素难以渗透，且易产生多重耐药（MDR）机制。因此，开发能有效穿透革兰氏阴性菌外膜的新型抗菌药物迫在眉睫。DNA旋转酶（DNA gyrase）是细菌IIA型拓扑异构酶，催化DNA负超螺旋形成，对细菌DNA复制与转录至关重要；该酶在人类中无直接同源物，是理想的抗生素靶点。已知的旋转酶抑制剂包括氟喹诺酮类（如环丙沙星）及新型药物gepotidacin和zoliflodacin，但耐药性已限制其疗效。

研究人员近期发现了一类全新作用机制的DNA旋转酶抑制剂——异喹啉磺酰胺（isoquinoline sulphonamides），先导化合物LEI-800通过结合一个前所未有的别构位点，将旋转酶-DNA复合物锁定在预裂解状态，从而抑制DNA切割。体外生化实验显示LEI-800对大肠杆菌旋转酶的IC₅₀为35 nM，且对耐氟喹诺酮临床分离株保持活性。然而，LEI-800的抗菌活性仅为中等水平（如对大肠杆菌ATCC 25922的MIC为4 μg/mL），主要归因于其外膜渗透性差——添加膜渗透增强剂多粘菌素B九肽（PMBN）后其活性显著提高。因此，该研究旨在通过结构修饰提高LEI-800的革兰氏阴性菌摄取能力，进而改善其抗菌活性。论文发表在《ChemMedChem》。

**2. 主要技术方法（不超过250字）**

研究人员采用以下关键技术方法：（1）合成化学：优化原始合成路线，通过格氏反应、还原胺化、Suzuki-Miyaura偶联等步骤构建中间体7，再与不同硼酸偶联制备伯胺类似物8–10，并进一步衍生为胍类似物11–13和铁载体（siderophore）轭合物14–16。（2）抗菌活性测试：采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），使用标准实验室菌株及多株耐药临床分离株（来自乌得勒支大学医学中心、莱顿大学医学中心、阿姆斯特丹大学医学中心等）。（3）生化抑制实验：基于凝胶的DNA超螺旋实验测定化合物对大肠杆菌旋转酶的IC₅₀，并评估对拓扑异构酶IV（TopoIV）的选择性。（4）膜渗透性评估：在添加PMBN条件下测定MIC协同效应，并利用外膜通透性增强的突变株E. coli ΔrfaD及外排泵缺失株E. coli ΔtolC进行对比。（5）分子对接：基于冷冻电镜结构（PDB: 8QQI），使用Schr?dinger Maestro软件进行对接分析。

**3. 研究结果**

**3.1 合成与结构修饰**

研究人员基于LEI-800的冷冻电镜结构，将远端芳环（原为吡啶基）替换为苯环，并在邻位、间位或对位引入伯胺，得到类似物8–10；进一步通过Goodman试剂将伯胺转化为胍基，得到11–13；再与2-氯-3,4-二羟基苯甲酸经HATU介导的酰胺偶联，得到铁载体轭合物14–16。新合成路线较原始方法效率显著提升（11步总产率9% vs. 12步1%）。

**3.2 抗菌活性评估**

MIC测定显示：对位取代的类似物10、13、16无活性（MIC >32 μg/mL）；三个铁载体轭合物14–16在铁缺乏培养基中也无活性，表明儿茶酚铁载体基团严重损害靶点结合。相比之下，邻位胺基类似物8、间位胺基类似物9和邻位胍基类似物11对大肠杆菌ATCC 25922和BW25113的MIC较LEI-800降低2–8倍（如8的MIC为1 μg/mL，LEI-800为4 μg/mL）。进一步对多株耐药菌株测试发现，化合物11对环丙沙星耐药株E. coli 1192和1146的MIC改善达8倍（分别为8和1 μg/mL）。此外，化合物8与9对肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌也表现出一定的活性改善。

**3.3 DNA旋转酶抑制活性**

凝胶超螺旋抑制实验表明，类似物8、9和11对大肠杆菌旋转酶的IC₅₀均低于LEI-800（40±2 nM），其中化合物11的IC₅₀为4±0.2 nM（增强了10倍），成为迄今报道的最强旋转酶抑制剂之一。所有异喹啉磺酰胺衍生物在最高测试浓度100 μM下对拓扑异构酶IV（TopoIV）无活性，显示出高选择性。

**3.4 膜渗透性研究**

在PMBN（8 μg/mL）存在下，LEI-800的MIC降低4倍，而类似物8、9、11的MIC仅轻微变化，表明这些类似物本身具有更好的外膜穿透能力。对外膜通透性增强的E. coli ΔrfaD突变株测试显示，所有化合物MIC均降至0.125–0.5 μg/mL，进一步证实渗透性改善。然而，在外排泵缺失株（ΔtolC和ΔbamBΔtolC）中，所有化合物的MIC低至0.001 μg/mL，说明外排泵仍是限制全细胞活性的关键因素。

**3.5 分子对接**

将化合物11对接到旋转酶别构位点（PDB: 8QQI）显示，其异喹啉磺酰胺和吡咯烷接头与LEI-800保持保守相互作用，而胍基侧链伸向DNA磷酸骨架，可能形成额外静电相互作用，从而解释其增强的抑制活性。

**4. 讨论与结论**

研究人员通过系统结构修饰，成功提高了LEI-800类异喹啉磺酰胺抑制剂的革兰氏阴性菌渗透性，其中邻位胍基类似物11兼具优异的旋转酶抑制活性（IC₅₀ = 4 nM）和改善的抗菌活性。膜渗透性研究表明，引入可电离胺基/胍基有助于跨越外膜屏障，但外排泵仍构成挑战。总体而言，该工作证实了基于“eNTRy”规则的渗透性增强设计策略的有效性，但也提示需同时优化多个参数以实现稳健的抗菌活性。

研究结论翻译：综上，研究人员描述了对近期报道的DNA旋转酶抑制剂LEI-800的一系列聚焦类似物的设计与合成。这些LEI-800类似物专门设计旨在通过增强外膜渗透性来提高抗菌活性。为此，研究人员利用优化的合成路线制备了三组化合物，每组分别引入不同的已知渗透性增强基团。在所制备的新类似物中，鉴定出一组表现出改善抗菌活性的化合物，即邻位和间位胺基官能化类似物8和9，以及邻位胍基官能化类似物11。这些化合物还显示出增强的DNA旋转酶抑制作用，IC₅₀值在低纳摩尔范围。值得注意的是，邻位胍基类似物11的IC₅₀为4 nM，作为DNA旋转酶抑制剂的效力比LEI-800强10倍，使其跻身于迄今报道的最强DNA旋转酶抑制剂之列。对接研究提示，与DNA磷酸骨架的额外相互作用在观察到的效力增加中发挥作用。为评估膜渗透性对LEI-800及类似物8、9、11活性的作用，研究了它们与已知外膜渗透剂PMBN的协同作用。共给药PMBN被发现对母体化合物LEI-800的抗菌活性产生强烈增强，而对于新类似物仅观察到适度的PMBN依赖性改善。这些结果与母体化合物比新类似物面临更大的渗透性屏障一致。采用外膜受损的E. coli ΔrfaD突变株进行的进一步研究也给出了符合这一趋势的结果，提供了新LEI-800衍生物渗透性改善的额外证据。尽管这些新类似物实现了强效DNA旋转酶活性和改善的外膜渗透性，但它们对外排的易感性在全细胞活性方面仍是一个问题。总体而言，研究人员的发现表明应用已建立的设计原则可以为改善革兰氏阴性菌渗透性提供有用的起点；然而，渗透性景观仍然复杂，必须优化多个参数才能实现稳健的抗菌活性。