Podoplanin（PDPN）单克隆抗体 SZ168 通过 ERK 信号通路减轻脓毒症炎症及巨噬细胞功能失调

《HUMAN MUTATION》：Podoplanin Antibody SZ168 Alleviates Sepsis Inflammation and Macrophage Dysregulation via ERK Signaling

　　

背景：脓毒症（Sepsis）是一种以过度炎症反应和免疫失调为特征的危及生命的疾病，巨噬细胞（Macrophages）在其中起核心作用。Podoplanin（PDPN，平足蛋白），一种跨膜黏蛋白型糖蛋白，在炎性巨噬细胞中上调，但其在脓毒症中的作用尚不清楚。 目的：探讨 PDPN 的作用及其中单克隆抗体 SZ168 在脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞中的治疗潜力，并通过体内补充实验及初步临床验证进行扩展观察。 方法：研究人员用 LPS 刺激 RAW264.7 巨噬细胞并以 SZ168 处理。通过蛋白质组学、实时荧光定量 PCR（qPCR）、Western Blotting、酶联免疫吸附测定（ELISA）及流式细胞术评估 PDPN 表达及 SZ168 对细胞因子分泌、极化、凋亡和细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路的影响。采用小干扰 RNA（siRNA）介导的 PDPN 敲低验证通路依赖性。修回阶段补充 MEK、p90RSK、c-Fos 的 Western Blot 验证、小鼠脓毒症模型体内实验及初步临床队列分析。 结果：LPS 刺激显著上调巨噬细胞 PDPN 的 mRNA 及蛋白水平。SZ168 处理降低 LPS 诱导的白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及 IL-1β 分泌，促进抗炎 M2 型极化并抑制凋亡。修回阶段 Western Blot 显示 SZ168 处理后伴随 SERPINE1 下调，MEK、p90RSK、c-Fos 及磷酸化 ERK（p-ERK）协同恢复，该现象在 PDPN 敲低细胞中更明显。体内补充实验显示 SZ168 降低血尿素氮（BUN）、肌酐及炎性因子，减轻肺损伤。初步临床队列中脓毒症患者血清 PDPN 水平显著高于对照组（23.81 ± 17.64 vs. 3.53 ± 0.58，p < 0.001）。 结论：PDPN 单克隆抗体 SZ168 通过在 LPS 诱导的巨噬细胞中调节 ERK 信号通路，减轻炎症反应、促进抗炎型巨噬细胞极化并抑制凋亡。修回补充的体内及初步临床数据进一步支持 PDPN 作为脓毒症治疗靶点的转化价值。

本研究发表于《Human Mutation》，围绕脓毒症（Sepsis）免疫失调机制及潜在治疗靶点展开。脓毒症由宿主对感染的失调免疫反应引起，导致细胞因子风暴、免疫失衡及多器官功能障碍，现有抗炎及免疫调节疗法效果有限。巨噬细胞（Macrophages）是先天免疫核心组分，可极化为促炎 M1 型和抗炎 M2 型，其失衡参与脓毒症进展。Podoplanin（PDPN，平足蛋白）是一种黏蛋白型跨膜糖蛋白，生理状态下静息巨噬细胞低表达，但脂多糖（LPS）等炎症刺激可显著上调其表达，并通过与 C 型凝集素样受体 2（CLEC-2）相互作用参与免疫调节，然而 PDPN 在脓毒症巨噬细胞功能及极化中的具体作用尚不明确。为此，研究人员探究了 LPS 诱导巨噬细胞中 PDPN 的表达变化、PDPN 单克隆抗体 SZ168 的免疫调节作用及分子机制，并补充小鼠脓毒症模型实验和临床患者队列分析以佐证转化意义。

为开展研究，研究人员使用小鼠巨噬细胞系 RAW264.7 及 LPS 诱导炎症模型，采用 CCK-8 检测细胞活力，流式细胞术检测巨噬细胞 M1（CD86⁺CD206^?）/M2（CD86^?CD206⁺）极化及凋亡（Annexin V-FITC/PI 双染），qPCR 检测 mRNA 表达，Western Blotting 检测 PDPN、ERK、p-ERK、SERPINE1、MEK、p90RSK、c-Fos 蛋白，ELISA 检测上清及血清 PDPN 和炎性因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）；以 siRNA 敲低 PDPN 验证通路依赖；补充小鼠脓毒症模型（对照组、模型组、模型+SZ168 50 μg/kg、模型+SZ168 100 μg/kg）检测肾损伤指标（BUN、肌酐）、组织病理及免疫荧光（F4/80 与 CD86/CD206 共染）；临床部分纳入脓毒症患者 57 例及健康对照 30 例，检测血清 PDPN 并与 SOFA 评分、IL-6 等行相关性分析。

3.1. LPS Stimulation Significantly Enhances PDPN Expression in Macrophages

研究人员通过蛋白质组学火山图与聚类、Western Blotting、ELISA 及 qPCR 检测，发现 LPS 刺激后巨噬细胞 PDPN 在蛋白及 mRNA 水平均显著上调，证实炎症刺激可诱导巨噬细胞 PDPN 高表达。

3.2. PDPN Monoclonal Antibody SZ168 Alleviates Inflammation and Regulates Macrophage Viability, Polarization, and Apoptosis in LPS-Treated Macrophages

研究人员经 CCK-8 确定 SZ168 无毒性浓度（2.5 和 5 μg/mL），发现 SZ168 降低 LPS 升高的细胞活力，下调 PDPN 蛋白，减少 IL-6、TNF-α、IL-1β 分泌；流式细胞术显示 SZ168 降低 M1 型比例、升高 M2 型比例，并减少 LPS 诱导的凋亡，表明 SZ168 具抗炎、促 M2 极化及抗凋亡作用。

3.3. Proteomic Analysis Identifies Molecular Targets Regulated by PDPN Monoclonal Antibody SZ168 in LPS-Treated Macrophages

标签游离蛋白质组学显示 LPS 引起 249 个蛋白上调、267 个下调，SZ168 逆转部分变化（165 个上调、209 个下调）。qPCR 与 Western Blotting 验证 LPS 降低 ERK（Erk）mRNA 及 p-ERK 蛋白、升高 SERPINE1，而 SZ168 恢复 p-ERK 并下调 SERPINE1。修回补充 Western Blotting 证实 SZ168 还恢复 MEK、p90RSK、c-Fos 表达，PDPN 敲低进一步增强此效应，提示 ERK 级联参与调控。

3.3.1. Additional MEK, p90RSK, and c-Fos Validation Further Supports ERK Pathway Involvement

研究人员补充检测 ERK 通路上游（MEK）及下游（p90RSK、c-Fos），LPS 使其表达降低，SZ168 部分恢复，且在 LPS+siRNA-PDPN+SZ168 组恢复最显著、SERPINE1 最低，强化 SZ168 通过协调调节 ERK 信号级联缓解炎症失调的结论。

3.4. PDPN Knockdown Confirms the Protective Effects of PDPN Monoclonal Antibody SZ168 via ERK Signaling in LPS-Treated Macrophages

以 siRNA 敲低 PDPN（siRNA-234 效率最高），研究人员发现 PDPN 敲低增强 SZ168 降低细胞活力、抑制炎性因子分泌、促进 M2 极化及抗凋亡的作用；Western Blotting 显示 PDPN 敲低增强 SZ168 对 p-ERK 的恢复及 SERPINE1 的抑制，确认 ERK 信号通路是 SZ168 发挥作用的关键机制。

3.4.1. Supplementary In Vivo Validation Shows That SZ168 Ameliorates Sepsis-Related Organ Injury and Macrophage Polarization

小鼠脓毒症模型补充实验显示，SZ168 降低血清及组织 IL-1β、IL-6、TNF-α，降低 BUN 和肌酐，减轻肺组织病理损伤；肺免疫荧光示 F4/80⁺CD86⁺（M1）信号减少、F4/80⁺CD206⁺（M2）信号增多，与体外促 M2 极化结论一致。

3.4.2. Preliminary Human Data Support Elevated PDPN Expression in Sepsis

临床队列分析显示脓毒症患者血清 PDPN 显著高于对照组（23.81 ± 17.64 vs. 3.53 ± 0.58，p < 0.001），SOFA 评分 ≥10 者高于 <10 者（p = 0.045），且与 IL-6 正相关（rho = 0.572，p < 0.001），初步支持 PDPN 在人脓毒症中异常升高。

讨论部分总结：本研究明确 LPS 上调巨噬细胞 PDPN 表达，PDPN 单抗 SZ168 通过调节 ERK 信号通路（恢复 MEK–ERK–p90RSK–c-Fos 轴活性、下调 SERPINE1）抑制炎性因子释放、促进 M2 型极化并减少凋亡；PDPN 敲低增强 SZ168 效应，体内外及初步临床数据共同支持 PDPN 可作为脓毒症免疫调节治疗的潜在靶点。局限性包括主要机制仍基于细胞实验、未做直接结合及 PDPN 敲除动物模型、未行盲肠结扎穿孔（CLP）模型及大样本临床验证。

结论（翻译）：PDPN 单克隆抗体 SZ168 通过在 LPS 诱导的巨噬细胞中调节 ERK 信号通路，减轻炎症反应、促进抗炎型巨噬细胞极化并抑制凋亡。修回阶段补充的体内实验及初步临床人源数据进一步支持 PDPN 作为脓毒症治疗中减轻巨噬细胞介导炎性损伤的潜力靶点。